1 蛋白質序列的檢索
1.1 從 NCBI 檢索蛋白質序列
http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Protein

一般來說,利用質譜數據鑒定蛋白質主要有兩種方法:肽質量指紋圖譜（PMF）和肽序列標簽分析（sequence tag analysis）。這兩種方法較傳統的 N 端測序或內部 Edman 測序法敏感數百倍，其檢測低限為飛摩爾（fmol）水平（如銀染的 2D膠點或 1D 膠帶）。

將 CBB 溶于甲醇中并不停的攪拌 15min。加入乙酸與 ddH2O

樣品制備是雙向電泳中最關鍵的一步，將直接影響 2-DE 結果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失；2）減少對蛋白質的人為修飾；3）破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態。

收集細胞。將培養瓶置于冰上，倒掉培養基，用PBS 或生理鹽水漂洗兩次，留適量液體于瓶內，然后用特制的細胞刮棒朝一個方向刮取細胞。將細胞懸液轉移到離心管，離心取沉淀，-800C 保存。（收集細胞要迅 速 ，

雜交時，為確認蛋白是否轉至PVDF膜上，可用下列方法對膜上蛋白進行可逆性染色。

樣品制備
電泳分離
蛋白的膜轉移
免疫雜交與顯色――蛋白檢測

制備單細胞懸液于 200μl 的 PBS 緩沖液中；
加入 2ml 預冷的 70%乙醇，4℃保存；

組織病理技術組織處理：1.取新鮮組織厚度不超過 5mm，10% 中性福爾馬林固定，大于 24 小時。2.固定后沖水 12-24 小時，3.75%酒精，1 次，1 小時，4.85%酒精，1 次，1 小時，5.95%酒精，3 次，1 小時

一、目的基因的克隆（以pshuttl-CMV質粒為例）1.選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入 pshuttl-CMV 質粒多克隆位點。

ELISPOT1.PBS 溶解抗原為 30 μg/ml，加 100 μl/孔于 PVDF 膜鋪底的 96 孔滅菌板過夜；2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培養基 100 μl 封閉 1 小時，37 oC；3. 準備脾

1.將 E.coli /phage lysate 以 1:10-20 稀釋在 TBST 溶液中。
2.將 4 張 82mm 的 nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的 E.coli/ phage
lysate 中，室溫下水平搖動 30 分鐘，取出 NC 并使膜瀝干。
3.用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分鐘。