免疫沉淀-裂解緩沖液和裂解物制備

免疫沉淀步驟

免疫沉淀是一種純化蛋白質的方法。將我們感興趣的一種蛋白質的抗體與細胞提取液孵育，以使抗體和蛋白質在溶液中結合。然后用蛋白A/G 耦合的瓊脂糖凝膠，從樣品中將抗體/抗原復合物提取出來。這種物理方法可將所需蛋白質從樣品中分離出來。然后樣品可以通過SDS-PAGE 分離出來進行Western blot 分析。

一、裂解緩沖液

理想的裂解液將保留蛋白質的天然構象，將抗體結合位點變性減到最少，同時從樣本中釋放足夠量的蛋白質，以滿足接下來的分析。非離子型去污劑比如NP - 40 和Triton X-100 比離子型去污劑如SDS 和脫氧膽酸鈉要溫和一些。其它可以影響到IP 成功的因素包括鹽濃度、二價陽離子濃度和pH 值。因此，要按如下范圍優化這些變量（摘自Harlow and Lane，231 頁，見參考部分67 頁）：

 0-1 M鹽

 0.1-2％ 去污劑，非離子型

 0.01-0.5％ 去污劑，離子型

 0-10 mM 二價陽離子

 0-5 mM EDTA

 pH 值：6-9

各種裂解液配方可以參考緩沖液部分：第11 章，第71 頁。

變性裂解液

用于去污劑可溶性抗原，并且抗體可識別其天然構象。

1.RIPA（放射免疫沉淀法）緩沖液

比裂解液NP - 40 或Triton X -100 更能使蛋白質變性，RIPA 緩沖液含有離子型去污劑SDS 和脫氧膽酸鈉作為活性成分，對裂解核膜進行核內提取特別有用。RIPA 緩沖液可以降低背景，但同時可使某些蛋白變性，包括蛋白激酶。

2. 不含去污劑的可溶性蛋白裂解液

使用含EDTA 和疊氮鈉的PBS。有些可溶性蛋白不需要使用去污劑。對細胞使用此緩沖液并加上機械破損，例如反復通過注射器或用Dounce 勻漿器勻漿。

3. 變性裂解液或用于不溶性抗原緩沖液的去污劑

天然蛋白質的抗原表位總是不容易靠近只識別變性蛋白質的抗體。當收集和裂解細胞時，用變性裂解液加熱細胞。這個方法也可用于非離子型去污劑不能從細胞中提取的抗原。用DNase1 將有助于從染色質中提取蛋白質。

9.1b 其他試劑

       蛋白酶抑制劑

一旦裂解發生，水解、去磷酸化和變性就開始了。如果樣本在冰上或始終在4°C 存放以及一開始就往裂解液中加入適當抑制劑的話，這些反應將可以大大減緩?；旌希ā半u尾酒”）的蛋白酶和磷酸酶抑制劑已經商品化了。如果不使用混合的蛋白酶抑制劑，IP 實驗中最常用的兩種蛋白酶抑制劑是PMSF（50μg/ml）和抑肽酶（1μg/ml）。磷酸酶和蛋白酶抑制劑的詳細資料，請參閱我們的蛋白質免疫印跡實驗指南。所需的其他試劑：

? 無菌PBS pH 值7.4

? 無菌PBS-牛血清白蛋白1％ W/ V（過濾）

? TBST 緩沖液

? 蛋白免疫印跡實驗的加樣/樣品緩沖液

? 100 mM EDTA 貯備液：1.86g EDTA 溶解到40ml 水中。加氫氧化鈉調整pH 至7.4。最后定容到50ml。

二、裂解物制備

       培養細胞的裂解

非變性：
       1. 將細胞培養皿放置冰上并用冰冷的PBS洗滌細胞。

2. 吸干PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每107 細胞/ 100mm2 培養皿/150cm2 培養瓶加1ml，每5x106 細胞/ 60mm2 培養皿/ 75cm2培養瓶加0.5ml）。

3. 用預冷的塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下，然后輕輕將細胞懸液轉移到預冷的EP 管中。

4. 4°C 持續振蕩30 分鐘。

5. 放入微型離心機4°C 離心。

您可能要根據細胞的類型更改離心力和時間。一個準則就是12,000rpm 20 分鐘，但是這必須由最終用戶決定（如白細胞需要輕度
離心）。

6. 從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。將上清液吸出轉移到預冷的新管（放在冰上）中，棄沉淀。

變性：

1.加100μl 變性裂解液至0.5-2 × 107 個細胞中。

2. 用渦旋混合器最大速度劇烈震蕩2-3 秒。將細胞懸液轉入EP 管。

(由于DNA 的釋放，這步的溶液是粘性的。)

3. 樣品加熱95°C 5 分鐘變性。

4. 用0.9 ml 非變性裂解液稀釋懸液,輕輕混合。（非變性裂解液中過量1％ Triton X – 100 可以淬滅原來變性緩沖液中的SDS）。

5. 將裂解的懸液通過1ml 注射器針頭5-10 次，把DNA 打成片段。

(重復機械斷裂直到把粘度降低到可操作的程度。如果DNA 沒有完全消化成片段，就會影響離心后分離上清和沉淀。）

6. 冰上孵育5 分鐘。

7. 進行免疫沉淀反應。

裂解物預清除可以幫助減少蛋白質非特異性結合到agarose (瓊脂糖)或Sepharose beads (凝膠瓊脂糖珠)。用無關抗體或血清預清除，可去除蛋白質與免疫球蛋白的非特異結合。最終實驗結果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白質是由免疫印跡實驗檢測，預清除未必必要，除非是污染蛋白質對目的蛋白質產生明顯干擾。

1.加入50μl 同種動物來源和型的無關抗體或正常血清作為免疫沉淀抗體（一些研究人員首選兔，參考Harlow and Lane，243 頁）到1ml 裂解物中，在冰上孵育1 小時。

2.加入100μl 珠漿。

3. 4°C 孵育10-30 分鐘并輕輕攪拌。

4. 微型離心機14000g 4°C 離心10 分鐘。

5. 丟棄珠子并保留上清進行免疫沉淀。

為了提高收率，珠子可用裂解液洗滌1 或2 次以上，并將上清收集在一起。

重要的是要確保盡可能多的去除正常血清，這是因為它會與特異抗體競爭靶抗原。為了檢查這一點，可以做一個測試：用裂解緩沖液代替樣品，如上進行所有預清除步驟?？捡R斯藍染色的凝膠將顯示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清沒有得到充分去除，泳帶將出現在50 和25 kDa 處，這是重鏈和輕鏈，它的存在可能導致一個弱的免疫沉淀反應。在預清除步驟，考慮降低血清量或增加與您的樣品孵育的珠子數量。

組織裂解

1.用干凈器械解剖所要的組織，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

2. 將組織放入圓底離心管中，浸入液氮中“速凍”。樣本在-80°C 儲存備以后使用或放在冰上立即勻漿。

3. 對于約5mg 組織，向管中迅速加入約300μl 裂解液并用電動勻漿器均漿。

4. 裂解液沖洗刀片兩次，每次300μl，然后4°C 持續振蕩2 小時（將回旋振蕩器放入冰箱）。

裂解液的體積根據組織總量來決定。蛋白提取物不宜過于稀釋，以避免蛋白質損失，并盡量減少樣品體積以便凝膠上樣。最小濃度
為0.1mg/ml；最佳濃度為1-5mg/ml。

（注：如果樣品需要變性，使用變性裂解液。）

5. 微型離心機4°C 12000rpm 離心20 分鐘。從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。吸出上清液放入預冷的新管（放在冰上）中，
棄沉淀。