流式細胞術—抗體染色方法和選擇合適的熒光色素偶聯物

一、抗體染色方法

直接染色

直接免疫熒光染色時，細胞與直接偶聯有熒光染料（如 FITC 標記）的抗體孵育。這種方法的優點在于只需要一步抗體孵育，從而排除了二 抗非特異性結合的可能性。這對細胞內染色特別有用，因為包含二抗的大抗體熒光復合物有可能被困住，造成非特異性結合甚或無法進入細 胞，而使一抗檢測不到。

間接染色

間接染色時，一抗是沒有標記熒光色素，而是通過帶有熒光色素標記的二抗進行檢測。這種二抗是對一抗具有特異性的抗體。另外可選擇使 用親和素-生物素系統，即使用偶聯了生物素的抗體，通過帶有熒光標記的親和素進行檢測。隨著目前有更多種類的偶聯二抗可以選擇，這種 方法意味著結合使用一種帶有熒光標記的二抗，可配合針對不同目標蛋白而沒有連接偶聯物的一抗，來進行流式細胞術的分析。這拓寬了研 究者對目標蛋白的選擇。

細胞內染色

使用流式細胞技術進行的細胞內源抗原的染色檢測成功與否，取決于各種不同的固定和通透方法，以使抗體接近細胞內部蛋白。任何情況下， 要獲得成功的染色都必須對實驗條件進行優化，包括測定抗體效價，采用合適的對照來正確設定流式細胞儀，并且優化固定和通透步驟。

檢測分泌蛋白

檢測分泌蛋白是相對困難，是由于蛋白在檢測前就從細胞中向外分泌或者迅速降解。進行此類實驗需要使用高爾基體阻斷劑(Golgi-Block)， 例如布雷非德菌素 A (Brefaldin A)。細胞與 Brefaldin A 孵育，可以阻止蛋白從高爾基體中釋放。任何已表達而停留在高爾基體內的蛋白，都 可以在細胞內被檢測，使用細胞內染色方法，便可檢測此類目標蛋白。

二、選擇合適的熒光色素偶聯物

對一個給定的抗體，能否從陰性信號中分辨出陽性信號，往往取決于所用的熒光色素偶聯物。各種熒光色素相對強度的一般準則是，從最亮到最暗：PE、PE-Cy7、PE-Cy5、APC > APC- Cy7、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700 > FITC、Pacific Blue、Alexa Fluor 488。這是一般模式。在個別抗體中，這相對強度的模式會有差異。一個有高表達水平的抗原，幾乎使用任何一種熒光色素都能檢測出其抗原和從陰性信號中分辨出來。水平較低的抗原或需要配合使用較亮的 PE 或 APC 這類偶聯物來獲取高信背比，以便從未染色細胞中充分地分離出陽性細胞。熒光色素的相對強度取決于儀器。這是由于不同的儀器上的激光和濾光片的組合存在差異。切記使用合適的流式細胞儀。