流式細胞術—散射光和熒光的檢測

用于對靶蛋白進行檢測/染色的熒光染料被相應激發波長的激光激發時將發出光線。那些被熒光標記了的顆粒或細胞，可以個別檢測和分析。

自染色細胞發出的前向和側向散射光及熒光被流式細胞儀內一套濾光片和反光鏡分成各個特定的波長并導向。熒光在流式細胞儀內被過濾， 使每個傳感器檢測的熒光只屬某特定波長。這些傳感器稱為光電倍增管 (PMT)。

PMT 將光子的能量轉換成電子信號 = 電壓。

例如：

FITC 頻道 PMT 檢測 FITC 發射大約 519nm 波長的光。（它也檢測任何其他熒光色素所發射出相近波長的熒光。） PE 通道 PMT檢測 PE 發射 575nm 波長的光。（每個 PMT 會檢測任何其他熒光色素所發射出相近波長的熒光。）

下圖展示了流式細胞儀光學器件的一個例子。

BP = 帶通濾光片；DL= 雙色長通濾光片/反光鏡；

流式細胞儀采用了不同的濾光片來引導正確波長的光子通過每個 PMT:

帶通 (BP) 濾光片允許透射窄范圍內波長的光子。

短通 (SP) 濾光片允許透射特定波長以下的光子。

長通 (LP) 濾光片允許透射特定波長以上的光子。

雙色濾光片/反光鏡（例如雙色 LP 長通反光鏡）安放在與光束形成 45° 角的位置。在長通雙色濾光片中，特定波長以上的光子直接透過，與 此同時特定波長以下的光子會以 90° 角反射。

信號檢測：

PMT檢測熒光細胞每次發射的光子所產生的電壓脈沖面積。

當熒光細胞通過激光束時，按一段時間內的光子數量所產生的峰或脈沖。它們被 PMT 檢測到并轉化為電壓脈沖。每個細胞的每個脈沖稱為 一次事件。測得的電壓脈沖面積與該事件的熒光強度直接相關。

1.當沒有熒光細胞通過光學儀器時，沒有光子發射，所以檢測不到信號。

2.隨著熒光標記細胞通過光學儀器并被激光照射，發射的光子數量增加，檢測到的電壓強度也相應增加。

3.當每個熒光細胞完成通過激光束的路程，隨著時間變化會形成一個電壓脈沖?？偯}沖高度和面積會被流式細胞儀檢測。該脈沖稱為一次 事件。每次的事件將會具有特定的強度，具體取決于所得脈沖面積。

脈沖面積由每個脈沖時間片（取決于 ADC 的速度）的高度值加起來而確定，其中脈沖時間片為 10 兆赫，即每秒 1000 萬個脈沖或每微秒 10 個脈沖。面積更好地代表了熒光總量。

這些事件根據脈沖強度（脈沖面積）而分配通道。

這些信號可以藉調高流過 PMT 的電壓而被放大。

根據其測量強度，每個事件賦予一個頻道編號?？偣灿?1024 個通道。熒光越強，事件分配的頻道編號越大。頻道編號與事件數量的曲線圖 是單參數直方圖。通常，這些頻道都以對數標度顯示在 x 軸上。

無染色的陰性結果

陽性結果

如觀察到陰性對照與陽性對照之間信號發生移位，此為陽性結果。 例如：ab21667 CCR2 抗人外周血單核細胞 (PBMC) 抗體染色，設門于單核細胞。

數據：匿名 Abreview