流式細胞儀常用的幾種檢測方法

一、測定用乙醇固定的DNA的含量

1、培養細胞的DNA含量的測定

制備單細胞懸液于 200μl 的 PBS 緩沖液中；加入 2ml 預冷的 70%乙醇，4℃保存；附細胞固定的一般步驟

1)取單細胞懸液 1～2×106 個細胞于 PBS（PH=7.2）緩沖液中；

2)300g 離心 5 分鐘，棄上清，反復兩次；

3)重懸細胞于 0.5ml PBS 緩沖液中；

4)將細胞懸液放置于 2～3ml 冷 70%乙醇中，混勻，保存于 4℃，至少 30 分鐘 。在 4℃條件下可保存 2~3 周。

注意：

根據實驗的要求，固定劑也可選用 1～3%多聚甲醛；

將乙醇作為固定劑時，乙醇應預冷至 0～4℃；

細胞在固定時，固定劑應緩慢滴入細胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細胞成團（特別是用乙醇固定時）。

300g 離心 5 分鐘，去上清，再重懸于 400μl PBS 中；

顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網過濾；

加入 PI（含 Rnase），避光孵育 30 分鐘；上機檢測。

2、新鮮組織的DNA含量的測定

1)用 200mg 濕重組織用機械法制成單細胞懸液；

2)500g 離心 5 分鐘；

3)棄上清，重懸于 10ml 染色-去污劑中；

4)再過濾，用 200 目的篩網或 70~80μm 的篩網過濾；

5)上機檢測。

3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定

1)從石蠟包埋切取切片 50 μm 厚，2~3 片，制成單細胞懸液；

2)用 PBS 緩沖液洗滌，500g 離心 5 分鐘，棄上清；

3)加入 PI 液 1ml 室溫避光 30 分鐘；

4)調整細胞濃度為 1×106/ml；

5)上機檢測。

二、細胞凋亡檢測及相關分子檢測

1、細胞DNA含量分布（由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡）

收集已固定的單細胞懸液約 5×105~1×106/ml；

離心除去固定液，3ml PBS 重懸細胞;

1500rpm 離心，5 分鐘 ，棄去 PBS；

加 PI 染液 1ml，室溫避光 20 分鐘；

調整細胞濃度 5×105/ml；

上機檢測。

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡

1)常 規 制 備 單 細 胞 懸 液 , 用 PBS 洗 兩 次 .( 若 為 全 血 要 先 溶血),取約 5×106 個細胞，1500rpm 離心,棄上清,用 400μl 1×Binding Buffer 重懸 ；

2)分成 a、b、c、d、e 五管，每管約 1×106 個細胞a)陰性對照，不加任何試劑；b)陽性對照,加 2%多聚甲醛固定 30 分鐘,加 AnnexinV 5μl,室溫 10min,用1×Binding Buffer 洗一次,棄上清再加 190μl 緩沖液、10μl PI 避光 15 分鐘c)加 10μl PI，避光孵育 15 分鐘；d)加 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 15min；e)加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min；

3)每管各加 400μl 1×Binding Buffer。

4)上機檢測。

注意:

a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；

b. 操作時注意避光；

c. 反應完畢后盡快檢測，最好在一小時內檢測。

3、用單克隆抗體 APO2.7 檢測細胞凋亡

1)放置 0.5~1×106個細胞到試管中；

2)室溫離心 200g，6min；

3)棄上清，加入 100μl 冷的（ 4℃）在 PBSF 溶液中含 100?g/ml 的digitonnin，輕輕地重懸細胞，在冰上孵育 20min；

4)加入 2ml 冷的（4℃）PBSF 液，室溫離心 200g，6min；

5)棄上清，加入 20μl PE 標記的 Apo2.7 單克隆抗體和 80μl PBSF 液，用vortex 輕輕震蕩，室溫避光孵育 15 分鐘；

6)加入 2ml PBSF 液，室溫離心 200g，6min；

7)棄上清，加入 1ml PBSF 液重懸細胞；

8)避光保存，直到流式細胞儀檢測。

PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

三、用流式細胞術進行DNA周期分析

1、方法：同 DNA 含量檢測

2、注意：

單細胞濃度應約 106/ml，以免影響檢測的 CV 值和檢測結果；

制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質量（如細胞是否聚集或過多碎 片 ），以保證得到足夠的細胞含量；

醛類固定會影響 PI 與核酸的結合。

四、免疫熒光標記法

1、細胞膜上的免疫熒光檢測法間接標記法

1)制備單細胞懸液；

2)細胞計數，取出 1×106 個細胞于試管中；

3)用臺盼藍染色計活細胞數，要求活細胞數 >90～95%；

4)在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育 30～60 分鐘；

5)PBS 洗滌 1～2 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清；

6)加入二抗，孵育 20～30 分鐘；

7)PBS 洗一次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

8)加 300μl PBS，上機檢測(若不能及時上機檢測，可加 1ml 1%多聚甲醛固定，可放置 1 周)。

直接標記法

①～③同間接標記法

④在試管中加入熒光標記的抗體，混勻，孵育 30 分鐘；

⑤用 PBS 洗 2 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上機檢測。

2、細胞膜內的免疫熒光標記法間接免疫熒光標記法

1)取已制備好的單細胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定 30 分鐘（也可 4℃保存過夜）；

2)用 PBS 洗兩次，棄上清；

3)細胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200ul，室溫 10 分鐘；

4)用 PBS 洗滌兩次；5)加入第一抗體，室溫 30～60 分鐘，或 4℃過夜，同時須設陰性對照或同
型對照管；

6)用 PBS 洗滌兩次；

7)加入二抗（熒光標記的抗體）室溫 20 分鐘，避光；

8)用 PBS 洗滌 1～2 次，棄上清；

9)重懸細胞于 500ulPBS 中，上機檢測。

直接熒光標記法

①～⑤同間接熒光標記法；

加入熒光素標記好的抗體，避光 30 分鐘（同時做同型對照管）；

用 PBS 洗滌１～２次，棄上清；

加 300ul PBS 上機檢測。

細胞膜上及細胞內雙標記法（直標法）

1)取出已制備好的未固定的單細胞懸液 1×10 6 個細胞于試管中；

2)用 PBS 洗滌兩次；

3)加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原，同時加上陰性對照管，室溫孵育 20 分鐘；

4)在試管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分鐘；

5)PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘，棄上清;

6)打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)用 PBS 洗滌兩次，棄上清;

8)加入用熒光素標記的抗體，標記膜內的抗原（標記膜內的抗體的熒光素的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務必不相同）室溫 20 分鐘孵育;

9)用 PBS 洗一遍棄上清；

10) 用 300μlPBS 重懸細胞，上機檢測

五、流式細胞術中的幾點注意事項：

1、對照組的設置：

在流式細胞術中所測得的量都是相對值，不是絕對值。如需知道絕對值時必須設置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

（1）、陰性對照的設置

在實驗過程中，如做間接標記法，可設置與一抗無關的實驗，即在實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照管，作為陰性對照。在實驗過程中，假設做直接標記法，可設置理論上的陰性細胞作為陰性對照管，實驗過程及步驟與實驗組務必相同。（做間接標記法時 ，同樣也可同時設置“陰性細胞”的陰性對照管作為陰性對照。在實驗過程中，假設做直接標記法，可將實驗組細胞，取一管，加上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。

（2）、陽性對照的設置：

在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗，應設置陽性對照組，其設置方法與陰性對照設置相同。

2、幾點建議：

1)在實驗過程中，在保證實驗的科學性和準確性的基礎上，應盡量減少實驗工序和過程。由于間接標記法的工序多，實驗過程長，如再加之操作的不熟練 ，細胞更容易丟失和受損，而造成實驗結果的誤差。因此，在條件允許的范圍內，建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法，以保證實驗的真實性和準確性。

2)建議送檢細胞一定要足夠量，一般要求 1×106 個細胞。不要過少。因為，如細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數，結果也不可信。細胞量也不宜過多，因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足，結果也由此受影響。

3) 同一種細胞需同時做雙標記時，須做雙標記的同型對照，且兩種抗體所標記的熒光顏色務必不同。