重組腺病毒構建，擴增及純化基本技術操作

一、目的基因的克?。ㄒ詐shuttl-CMV質粒為例）

1.選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入 pshuttl-CMV 質粒多克隆位點。

2. 重組質粒鑒定： 酶切鑒定或測序。

3. 重組質粒擴增，純化并準備適量含目的基因的穿梭質粒。

4. 用 PmeI 單酶切線性化重組穿梭質粒，電泳鑒定質粒完全被切開。

5. 膠回收線性化質粒，以備共轉化使用。

二、共轉化

1、大腸桿菌 BJ5183 電轉感受態制備

從新鮮瓊脂板上挑取單個 BJ5183 細菌，接種于 LB 培養基中，37℃振搖過夜 。接種 25ml 過夜培養物于 500ml LB 培養基，37℃振搖，至 OD600 達到 0.4。迅速將培養物置于冰浴中 30min，至充分冷卻。將菌液轉移至預冷的離心管中，4℃下以 2500r/min 離心 15 min，棄培養液，回收細胞。以 10ml 預冷的 10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。加約 1ml（適量）預冷的 10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液 100 倍，測量 OD600 ，至稀釋濃度為 2-3×1010 個細胞/ ml (1.0 OD600 約 2.5×1010 個細胞/ml)。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2、病毒骨架質粒轉化大腸桿菌，擴增，純化。

3、將 1-5?l (約 1?g) 線性化的穿梭質粒及 1?l（約 100ng/?l）病毒骨架質粒（如pAdEasy-1）加入至含約 40?l BJ5183 電轉感受態的 EP 管中混勻,冰上冷卻。

4、將混合物加入電轉杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。

5、電擊結束取出樣品，加入 1ml SOC 或 LB 培養液，37℃低速振蕩 40min。

6、取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養 16-20hr。

7、次日挑取平板上長出的菌落（選擇最小的菌落）,接種于 3ml 含 25-50mg/ml的 LB 培養基，37℃培養 10-15hr。

8、堿裂法提取質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定。以 PacI 單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約 3.0 或 4.5kb）（同時可進行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。

9、取1-5?l 陽性質粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞（BJ5183為recA+,質粒DNA易發生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩定擴增已鑒定的重組質粒），擴增細菌并純化質粒。

三、重組病毒質粒轉導293細胞

1、293細胞培養：轉導24小時前，以方瓶為例，接種2×106293細胞于25cm2方瓶，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2、以PacI單酶切重組病毒質粒（轉導25cm2方瓶約需4?gDNA），完全線性化后，乙醇沉淀，再以20 ?l ddH2O溶解。

3、脂質體包裹質粒（以Lipofectamine為例）:每4?g PacI約需20?l Lipofectamine包裹.質粒及脂質體分別稀釋于500?l無血清培養基再混合,置于室溫下15-30min。

4、以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶，另加2.5ml無血清培養基，37℃放置10min。

5、將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶，37℃孵箱放置4hr。

6、4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養基（含10%FCS）。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養基，37℃孵育過夜，再換液。

7、培養過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變（CPE）出現（如用pAdTrack-CMV質粒，由于含GFP，可觀察到綠色熒光）。

四、重組病毒鑒定

1、轉導10-14d后，收集細胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心后收集上清保存于-80℃。

2、取 30-50% 步驟 1 中上清，感染 50-70%飽和度的 25cm2 方瓶中 293 細 胞 。2-3d后出現明顯細胞病變。

3、感染后 3-5d,當 1/3-1/2 細胞漂浮時收集病毒。按步驟 1 收集細胞并準備病毒上清。通過 Western blot 和/或 PCR 鑒定重組腺病毒產生。

4、PCR 鑒定重組病毒。取 5?l 病毒上清加入 10?l 蛋白酶 K，55℃孵育 1hr，再煮沸 5min，離心后取 1-2?l 作 PCR。

五、重組病毒擴增，純化

1、75cm2方瓶中接種 293 細胞，至密度達到 90%，加入適量病毒上清感染細胞。3-4d 后，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮，則收集所有細胞。約 500g 轉速離心，棄上清。

2、以滅菌 PBS 重懸沉淀，反復凍融 4 次。4℃下 7000g 離心 5min.病毒純化至少需要 30 瓶 75cm2方瓶細胞。

3、CsCl 連續梯度離心純化：50ml 離心管中稱量 4.4g CsCl，加入 8ml 病毒裂解上清液，混勻，體積約為 10ml。轉移至 12ml 超速離心管（用于 SW41 轉頭）中，覆蓋約 2ml 礦物油。平衡后，10℃下 32000 rpm 離心 18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。（也可 CsCl 不連續梯度離心：20ml 超速離心管中緩慢加入 8ml CsCl 1.4 (53 g +87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入 6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達到 20ml。平衡 后 ，4℃下 23000rpm 離心 90min (SW28 轉頭)，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）

4、病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），滅菌處理。4℃透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六病毒滴度測定（TCID50）

1、細胞準備:96孔板中接種100?l 293細胞,每孔細胞數約104個,以2% DMEM培養

2、稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度（如10-3-10-10），每個濃度重復10個，每孔加入病毒稀釋液100?l。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下，孵箱培養10天。

3、10d后觀察細胞，記數每排出現CPE的孔數，計算細胞病變率。（如某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0）。

4、計算T =10×101 + d (S - 0.5) /mld = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）S = 各濃℃細胞病變比率之和實驗室重組腺病毒常用質粒：病毒骨架質粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2穿梭質粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV。