ELISPOT/藻酸鹽包裹實驗

ELISPOT

1.PBS 溶解抗原為 30 μg/ml，加 100 μl/孔于 PVDF 膜鋪底的 96 孔滅菌板過夜；

2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培養基 100 μl 封閉 1 小時，37 oC；

3. 準備脾細胞懸液（用氯化銨去除紅細胞，制備成單個脾淋巴細胞懸液）；

4. 從 1 × 106/孔開始，按 1:3 的稀釋度開始逐孔稀釋做不同濃度梯度，并做 3 個復孔，37 oC 靜置培養 5 小時；

5. PBS 洗 3～5 次，生物素化的抗鼠 IgG 二抗孵育 30 min；

6. PBS 洗 3～5 次，鏈親和素標記的堿性磷酸酶孵育 30 min；

7. PBS 洗 3～5 次，用底物 BCIP/NBT 顯色，顯微鏡下觀察顯色反應，顯色后及時終止反應；

8. 計數每孔中的斑點數目，計算每 106 個脾細胞中抗體分泌細胞數量。

藻酸鹽包裹實驗

1.將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水，終濃度為 1.5%；

       2. 收集培養的腫瘤細胞，用無血清的培養基洗滌 1 次，將細胞沉淀重懸于 1.5%藻酸鈉溶液中；

3. 將上述腫瘤細胞懸浮液用 1 ml 加樣槍緩慢滴入磁力攪拌的 250 mM CaCl2 溶液中，形成乳白色的藻酸鹽小珠。繼續靜置于 250 mM CaCl2 中 30 min 即可使用。以上操作步驟均在無菌條件下進行；

4. 將第 4 次免疫后 7 天的小鼠用苯巴比妥鈉 0.1ml (按 100 mg/kg 計) 腹腔注射麻醉，小鼠麻醉后置于解剖臺上，切開背部皮膚，皮下植入 4 粒藻酸鹽包裹顆粒，縫合皮膚，外敷手術膠膜；

5. 天以后，小鼠經尾靜脈注入100 μl (按 100 mg/kg計) FITC 標記的葡聚糖(FITC-Dextran)；

6. 20 min 后處死動物，取出藻酸鹽顆粒，常溫下加入 1 ml 的生理鹽水，剪碎研磨顆粒，再加入 1 ml 的生理鹽水,混勻標本，放置 1 小 時 ，1500 rpm 離心 5 min。取上清液用熒光酶標儀測定；

7. 用不同濃度的 FITC-Dextran 制備標準曲線。