無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。

這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做 WesternBlot 和免疫組化。

一抗的稀釋度是有說明的，根據你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－ 5ml

這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢，你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分 子的就有可能會變淡。

可以。

PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結 合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬 于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間 結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位， 那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP 標記的二抗。

抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3 次。稀釋 后應在 2－3 天內使用，4 度保存，避免反復凍融。

比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

上樣量要根據實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的WesternBlot 則上樣量要均等，如 果只是要定性，則沒有太大的關系，盡量多上就行了，但是不要超載。

a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；

b)用5 倍的上樣緩沖液來稀釋變性