1.試劑盒使用前，通常需要在室溫下平衡30-60min。(溫度對酶催化反應有影響）。

2.洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，但盡量避免漏液溢液，以每孔300 μl為宜；板洗次數一般為3次，要保證洗板的浸泡時間，每次浸泡時間一般為30-60 秒；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板后進行拍板，并及時更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應孔內。

比色法：特定波長光穿透樣品，光被吸收的情況。（酶標儀）（分光光度計）

熒光法：特定波長光，激發染料，發出其它波長光的情況。（熒光/多功能，酶標儀）

1.找到這個抗體的免疫原，什么蛋白的抗體?！玖粢鈶妙愋秃头磻N屬】 或者，在【靶標】這一欄觀察，SwissProt 這一欄，至于是選人的還是小鼠的， 根據客戶實驗需求來?？梢渣c擊進去，進入 Uniprot 數據庫。

2. (Uniprot ID: P25054).這是數據庫的 ID，類似身份證，打開數據庫：http://www.uniprot.org/ ，輸入 ID，P25054，搜索。

3.

全名如圖，可以用全名和縮寫去搜索抗體。并在其它品牌的產品頁面，留意觀 察抗原的信息，是否與數據庫的一致 ···這個 ID 相同，就像身份證號碼一樣，指示是同一個人。 

案例：（問題，是否為同一個蛋白，是否可以替換為 Abbkine 產品） 

1. http://www.alomone.com/p/anti-angiotensin-(1-7)_mas_receptor/agp-099/119 

2. http://www.abbkine.com/product/mas1-polyclonal-antibody-abp57206/

●膜上多處出現黑點或黑斑原因：抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。 

●反白（條帶顯白色）原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。 

●蛋白分子量偏低或偏高原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

可能的原因及建議： 

●檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。 

●檢測樣本低表達目的蛋白提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。 

●轉移不完全或過轉移可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過 頭；適當調整轉膜的時間和電流。 

●抗體不能識別測試種屬的相關蛋白購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測 試種屬的對應蛋白。 

●一抗孵育時間不足建議 4℃結合過夜。 

●二抗與一抗不匹配 選擇針對一抗來源的種屬的抗體。 

●洗膜過度洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑 Tween-20。

操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發性試劑應在通風櫥中進行。

可能的原因及建議： 

●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條 帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

●目的蛋白有其它剪切本查閱文獻或生物信息學分析可能性。 

●樣本處理過程中目的蛋白發生降解加入蛋白 酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。 

●上樣量過高，太敏感適當減少上樣量。 

●一抗特異性不高重新選擇或制備 高特異性的抗體。 

●一抗不純純化抗體 

●一抗或者二抗濃度偏高降低抗體濃度。

●︶條帶呈笑臉狀 原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;電泳系統溫度偏高。 

●︵條帶呈皺眉狀原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚 合不完全。 

●拖尾原因：樣品溶解不好。 

●紋理（縱向條紋）原因：樣品中含有不溶性顆粒。 

●條帶偏斜原因：電極不平衡或者加樣 位置偏斜。

●條帶兩邊擴散原因：加樣量過多。

可能的原因及建議： 

●膜封閉不夠延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。 

●一抗稀釋度不適宜對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。 

●一抗孵育的溫度偏高，建議 4℃結合過夜。 

●選擇的膜容易產生高背景，一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF 膜低。 

●膜在實驗過程中干過實驗過程中要注意保持膜的濕潤。 

●檢測時曝光時間過長，減少曝光時間。

小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去 了。