染色質免疫沉淀—ChIP 疑難解答

無特異性抗體對照時出現背景過高

與蛋白A 或G 非特異性結合

應采用預清除處理，即在加入抗體前，將裂解的樣本與磁珠混合1小時然后分離使用。

染色質免疫沉淀所用緩沖液被污染

裂解液和洗滌緩沖液要新鮮配制。

某些蛋白A 或G 磁珠本身會產生很高的背景

某些蛋白A 或G 磁珠會有很高的背景。要找到一個合適的供應商，所提供的產品應在非特異性對照樣本中得到背景最低最干凈的結果。

結合區域過大使得背景過高分辨率過低

片段過大

針對不同的細胞系，應優化DNA 片段的大小。超聲時間和酶孵育時間均應調整。建議DNA 片段不要超過1.5kbp。如果用酶消化染色質，會得到175bp 大小的單核苷酸酶。

信號過低

染色質片段過小

要得到小于500bp 的染色質片段時，不需進行超聲處理。太小的片段會使核小體被誤認為核小體間的DNA 而被消化掉。如果進行末端染色質免疫沉淀，通常酶消化法即能得到所需大小的染色質片段。

交聯染色質免疫沉淀時交聯時間過長

用甲醛交聯10-15 分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液洗凈，接著需要加入甘氨酸以終止甲醛的作用。過度交聯可能會降低表位的可結合度從而減少抗體的結合。

原材料不足

建議每個免疫沉淀反應用25μg 染色質

免疫沉淀中抗體不足

建議開始時加入抗體量為3-5μg。如果未檢測到信號，可增加抗體量至10μg。

特異性抗體結合受阻礙

在洗滌緩沖液里氯化鈉濃度不要高于500mM，否則濃度過高將阻礙特異性抗體結合

細胞裂解不充分

建議用RIPA 緩沖液來裂解細胞

目標區域無足夠的抗體

目標區域無表位。應有陽性對照抗體，以確認操作過程無誤，如H3K4me3 用于活化的啟動子，或者H3K9me3 抗體用于異染色質位點。

有些單抗不適合做交聯染色質免疫沉淀

單抗識別的表位可能會在交聯過程中被掩蓋，而阻礙位點識別。建議用多克隆抗體，可識別多個表位，這樣就增加了免疫沉淀目標蛋白的幾率。

用錯了抗體親和性磁珠

蛋白A 和G 是細菌來源蛋白質，其對不同種的免疫球蛋白的親和性不同。請使用特異性的親和基質。建議使用混合好的蛋白A 和蛋白G 瓊脂糖。

免疫沉淀DNA 時PCR 擴增的問題

反應后包括無模板的陰性對照在內均出現很高的信號

實時PCR 所用試劑被污染。建議使用儲備液來新鮮配制溶液。

樣本中無DNA 擴增

使用標準對照/抽樣DNA 以確定樣本中引物均有效。