染色質免疫沉淀—交聯染色質免疫沉淀(X-ChIP) 操作步驟

染色質免疫共沉淀是一種強力的手段，來聯系蛋白質或其修飾位點與基因組的關系。染色質分離并用特異性抗體判斷是否與特異性DNA 序列相結合。染色質免疫沉淀法亦可用來檢測目的位點在基因組中的時空分布（用芯片或DNA 測序）。本操作規程詳細闡述了交聯染色質免疫沉淀(X-ChIP) 實驗的具體步驟。

1.交聯和細胞收集

(用甲醛來使蛋白質和DNA 相交聯。交聯的時間很關鍵，因此需優化。建議樣本交聯的時間為2-30 分鐘。

過度的交聯可降低抗原的可結合性和超聲的效率。抗原的表位也會被遮蓋。甘氨酸可抑制甲醛的作用并終止交聯反應。)

1.1 取2 個150cm2 培養皿的融合細胞(每皿細胞數約1 X 107 - 5 X 107 個)。向培養基中滴加甲醛以使蛋白和DNA 相交聯，甲醛的終濃度為0.75%（體積百分比），室溫下輕輕搖動10 分鐘。

1.2 加入甘氨酸至終濃度為125mM，輕輕振蕩孵育5 分鐘。

1.3 用10ml 冷PBS 洗滌細胞2 次。

1.4 刮下細胞并用5ml 冷PBS 收集，轉移至一個50ml 離心管中。

1.5 用3ml PBS 洗滌培養皿，收集剩余細胞至50ml 離心管中。

1.6 1000g 離心5 分鐘

1.7 小心吸棄上清液，用FA 裂解緩沖液重懸沉淀(每1 X 107 個細胞加750μl)

(用細胞懸液實驗時，起始細胞量為1x107- 5x107 個細胞，并按照第一部分的步驟加入體積百分比0.75% 的甲醛和甘氨酸。

離心沉淀細胞（5 分鐘, 1000g）。用冷PBS 洗滌3 次，用FA 裂解液重懸沉淀（每1 X 107個細胞加750μl）。然后轉到步驟2.1。)

2. 超聲

當使用組織來進行實驗時（見步驟6.2），要得到單細胞懸液，應從此步超聲處理開始。

2.1 將裂解液超聲處理以使DNA 斷裂成約500-1000bp 的片段。不同的細胞系需要不同的超聲時間，因此需分別進行優化。

交聯后的裂解液應進行超聲處理，并優化得到最佳條件。取部分樣本按照步驟3 進行DNA 分離。

片段大小應按照圖1 所示，用質量百分比1.5% 的瓊脂糖凝膠分析。

2.2 超聲處理后，4°C，8000g 離心30 秒使細胞碎片沉淀。將上清液轉移到新管中。此染色質溶液將用于步驟4的免疫沉淀（IP）。

2.3 每個超聲后的樣本均取50μl，此樣本為抽樣樣本，用于定量DNA 濃度（見步驟3），并作為PCR 的對照樣本。

(超聲后的染色質可在液氮中速凍，在-80°C 中可保存2 個月。應避免反復凍融。)

圖1. U2OS 細胞分別超聲5、10、15 和20 分鐘。隨時間的延長，所得片段大小逐漸減少。超聲15 分鐘后可得到最適片段大小。

注意：超聲時間過長會使核小體與DNA 的交聯斷裂，因此條帶大小不應低于200bp。

3. DNA濃度測定

3.1 抽樣樣本用來測定DNA 濃度，為后續IP反應提供數據。用PCR 產物純化試劑盒（加70μl 洗提緩沖液，轉至步驟3.2a）或酚:氯仿（加350μl 洗提緩沖液，轉至步驟3.2b）來純化DNA。

3.2a 加入2 μl RNA 酶A (0.5 mg/ml)。置于65°C 恒溫振蕩4-5 小時（或過夜）以解交聯。按照PCR 產物純化試劑盒說明書來純化DNA。用DNA 純化試劑盒來純化DNA 時，RNA 濃度過高會干擾DNA 的純化過程，因此樣本中應加入RNA 酶A 處理。否則純化柱吸附飽和時產物會大大減少。

3.2b 加入5μl 蛋白酶K (20mg/ml)。65°C 恒溫振蕩4-5 小時（或過夜）以解交聯。酚:氯仿抽提DNA，乙醇沉淀中加入10μl 糖原(5 mg/ml)。用100μl 水重懸沉淀。樣本可凍存于-20°C 冰箱中。樣本用蛋白酶K處理，可使脂肪與芳香族氨基酸的羧基鄰近的肽鍵斷裂。破壞蛋白質和DNA 的交聯可幫助DNA的純化。

3.3 DNA 濃度測定: 取5μl 純化DNA，加入裝有995μl TE的離心管中，200 倍稀釋，測定OD260。根據公式DNA 濃度（μg/ml）=OD260 x10,000，計算每毫升染色質溶液中DNA的濃度。

4. 免疫沉淀

4.1 使用步驟2.2 中得到的染色質溶液繼續此操作。建議每個免疫沉淀反應DNA 含量約為25μg。每個樣本用RIPA 緩沖液1:10 稀釋。應設一個抗體對照和一個僅加磁珠的對照。

4.2 除對照外，其余樣本中均加入一抗。事先應通過預實驗得到最佳的抗體加入量。一般來說，每25μg DNA 加入1-10μg 抗體。

4.3 所有樣本均加入20μl 的蛋白A/G 磁珠（預吸附了鮭魚精DNA 和牛血清白蛋白，見步驟4.3a），進行免疫沉淀反應，4°C旋轉過夜。

4.3a 蛋白A/G 磁珠與鮭魚精DNA 混合液的制備：如果使用蛋白A 和蛋白G 兩種磁珠，應將其等體積混合，并用RIPA 緩沖液洗滌3 次。

吸棄RIPA 緩沖液，加入鮭魚精DNA 至終濃度75ng/μl，同時加入牛血清白蛋白至終濃度0.1μg/μl。加入等體積RIPA 緩沖液，

常溫旋轉孵育30 分鐘。用RIPA 緩沖液洗滌一次，然后加入等體積RIPA 緩沖液。

應使用蛋白A 磁珠、蛋白G 磁珠或兩種混合物。61 頁第9.5 部分的表中列出了兩種磁珠對不同種屬免疫球蛋白的不同親和性。

4.4 將蛋白A/G 磁珠離心，2000g 1 分鐘，棄上清。

4.5 用1ml 洗滌緩沖液洗滌磁珠3 次。2000g 離心1 分鐘。

4.6 用末次洗滌緩沖液洗1 次。2000g 離心1 分鐘。

(如果背景過高，則應增加洗滌次數?；蛘?，在步驟4.2 之前將超聲處理后的染色質與蛋白A/G 磁珠共孵育1 小時，以去除背景。

此步將消除與磁珠的非特異行結合。將上清液（超聲處理的染色質）轉移至一個新管中，然后按照前述步驟4.2 將抗體與磁珠孵育。)

5. 洗滌和解交聯

5.1 洗滌DNA：向蛋白A/G 磁珠中加入120μl 洗滌緩沖液，30°C 旋轉15 分鐘。

5.2 2000g 離心1 分鐘。將上清液轉移至新管中。樣本可于-20°C 保存。

5.3 純化DNA 可用PCR 純化試劑盒（見步驟3.2a）或酚:氯仿（加280μl 洗提緩沖液，然后參照步驟3.2b）法進行。

5.4 DNA 可用實時PCR 進行定量檢測?？捎脤崟rPCR 儀自帶的軟件進行引物和探針設計?；蛘?，也可以使用在線設計工具進行設計。

6. 組織免疫沉淀中染色質的制備

此步驟描述了從組織中制備染色質，以用于后續的染色質免疫沉淀反應。每個免疫沉淀/抗體反應推薦使用組織30mg，但組織使用量可根據實際進行調整。每種組織的用量依據組織蛋白豐度、抗體親和力和交聯效率而定。每個免疫沉淀反應最適染色質的量為5-15μg。每次交聯免疫沉淀反應之前，需根據不同組織類型確定具體的染色質需要量。應先按照下述方法制備染色質溶液，

再進行交聯免疫沉淀反應。所有溶液中均應添加蛋白酶抑制劑（10μl/ml 的PMSF，1μl/ml 的抑肽酶和1μl/ml 的亮肽素，溶于PBS 中）。
本部分摘自Henriette O’Geen, Luis G. Acevedo 和Peggy J. Farnham 提供的操作規程。
6.1 交聯

(冰凍組織應置于冰上融化（根據組織用量的不同，此過程可能需要幾個小時不等）。注意，冰凍組織融化時溫度不能過高，以免蛋白酶活化使組織降解。操作過程中樣本要一直置于冰上，所有操作均應迅速完成，以使其處于融化狀態的時間最短。組織切塊時要在培養皿中進行，其下要放置一塊干冰。)

6.1.1 用刀片將冰凍或新鮮組織切成小塊（1-3mm3）

6.1.2 取一個空的15ml 錐形離心管，稱重，放入組織后再次稱重，計算組織重量。

6.1.3 在通風櫥中配制交聯所用溶液。每克組織加10ml 磷酸鹽緩沖液。加入終溶度1.5%（v/v）的甲醛，室溫旋轉15 分鐘。

6.1.4 加入甘氨酸至終濃度0.125M，以終止交聯反應。繼續室溫旋轉5 分鐘。

6.1.5 組織樣本離心，4°C 720 rpm，離心5 分鐘。

6.1.6 吸棄培養基，用10ml 冰上預冷的PBS 洗滌。4°C 720 rpm，離心5 分鐘，棄掉洗滌緩沖液。

(此步所得組織可以用液氮速凍，然后保存于-80°C。應避免反復凍融。

如果隨后使用，可以用冷PBS 重懸組織，每克組織加10ml，冰上放置。)

6.2 組織降解

應用Becton Dickinson 生產的Medimachine（中型研磨器）處理得到單細胞懸液。每克組織使用2 個中號錐形研磨管(50μm)。

6.2.1 將1ml 槍頭的末端剪掉，使吸頭口增大。

6.2.2 50-100mg（3-4 塊）的組織用1ml PBS 重懸。

6.2.3 將溶液加入錐形研磨管中，研磨2 分鐘。

6.2.4 將18 號鈍圓的針頭連接到1ml 注射器上，將其插入錐形研磨管中收集細胞。將細胞加入一個錐形管中，冰上放置。

6.2.5 重復步驟2.2 直到所有組織均處理完。

6.2.6 鏡下觀察細胞懸液，以確定得到的是單細胞懸液。如果需要進一步研磨，可在組織中加入更多的PBS，重復步驟2.2 到2.5 直至所有組織均研磨成均一的懸液。

6.2.7 將細胞離心，1000rpm，4°C，離心10 分鐘。估算細胞沉淀的體積以備下一步操作。

6.2.8 小心吸棄上清液，用FA裂解緩沖液重懸沉淀（每1x107 個細胞加入750μl）。

6.2.9 從第2 階段（超聲處理）開始，繼續進行交聯染色質免疫沉淀反應。