免疫沉淀疑難解答

高背景

去污劑不溶性蛋白有殘留

離心后立即去除上清。沉淀中留有不溶性蛋白質，如果再次有懸浮發生，再次離心。

洗滌不充分

蓋上管蓋離心前反復顛倒幾次。

非特異性蛋白質與珠子結合。

珠子用BSA 預封閉不充分。確保牛血清白蛋白（組分V）新鮮，新鮮珠子與含1％ 牛血清白蛋白的PBS 孵育1 小時，使用前PBS 洗3-4 次。

使用的抗體特異性不夠。

使用親和純化的抗體，最好預先吸收。

使用太多抗體導致非特異性結合

檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體。

細胞裂解液中含有太多的細胞或太多蛋白質，導致洗脫液中有很多額外的（假陽性）蛋白質。

減少細胞數量/裂解液使用。我們推薦使用10-500μg 細胞裂解液。

蛋白與抗體非特異性結合

如果有很多非特異結合的蛋白質，可以嘗試減少上樣珠子的樣本數量。您還可以在開始免疫沉淀實驗之前預先孵育珠子和準備好的裂解液（請參閱實驗方案）來預清除裂解液。這應該清除裂解液內任何與珠子非特異結合的蛋白質。一些研究人員也使用同種來源和相同免疫球蛋白亞類的無關抗體來預清除裂解液。

免疫沉淀實驗時抗原降解

確保樣品裂解時加入新鮮的蛋白酶抑制劑。

大量抗體被洗脫

太多抗體與目標蛋白質洗脫嘗試減少抗體用量。免疫沉淀前將抗體與珠子交聯，并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫將大大減少抗體洗脫量。

沒有檢測到目的蛋白洗脫

所用樣品中不表達或低水平表達目標蛋白質檢查目標蛋白質的表達譜，以確保它會在您樣品的細胞表達。如果有目標蛋白低水平表達，增加裂解液的使用量。但是，這可能導
致增加非特異性結合，所以開始免疫沉淀程序之前最好預先清除裂解液。

沒有足夠的抗體捕獲目標蛋白

檢查抗體的建議使用量?？贵w濃度可能需要增加。

目標蛋白沒有從珠子上洗脫

確保您使用的洗脫緩沖液是正確的，并且是洗脫蛋白質所需的正確強度和pH值。

抗體沒有結合免疫吸附磁珠

確保您使用的珠子與抗體亞型匹配。

使用的裂解液不正確

檢查說明書，看看抗體是否能檢測變性蛋白質或天然蛋白質，并確保使用正確的裂解液。