免疫沉淀-用DMP 如何把抗IgM 抗體與蛋白A 或G 涂層的珠子耦合

此方法涉及抗IgM 抗體的IgG 耦聯蛋白A 或G 珠子（方法見下文）。這些珠子就可以在常規免疫共沉淀程序中使用IgM 抗體。通過結合抗-IgM 抗體，IgM 可以間接結合珠子。
下面的過程介紹了用DMP 如何把抗IgM 抗體與蛋白A 或G 涂層的珠子耦合：

試劑：

200mM 硼酸鹽緩沖液+ 3M 氯化鈉pH 值9.0

含20mM（DMP）的200mM 硼酸緩沖液+ 3M 氯化鈉，pH 值9.0

200mM 乙醇胺pH 值8.0（乙醇胺儲液1:80 稀釋）

磷酸鹽緩沖液（PBS）

PBS+ 0.1％ 疊氮化鈉

200mM 甘氨酸pH 值2.5

蛋白A 或G 珠子（Sepharose）

方法：

我們建議每ml 濕珠子使用每2mg 抗體（使用適當的抗體/蛋白A 或G 結合物）。

1.使用前1 小時將250mg 蛋白A 或G Sepharose（珠子）加入2ml PBS+0.1％ 疊氮鈉。這使得珠子膨脹。

2. 將珠子與適當濃度的抗體室溫混合2 小時（旋轉或滾動）。

3. 2500rpm 離心5 分鐘。

4. 10 倍體積200mM 硼酸緩沖液+ 3M 氯化鈉洗珠子兩次。

5. 20mM DMP 重懸珠子。

6. 室溫旋轉/振蕩珠子30 分鐘。

7. 將珠子2500rpm 離心5 分鐘。

8. 200mM 硼酸鹽緩沖液+ 3M 氯化鈉洗珠子2 次。

9. 20mM 乙醇胺洗珠子1 次。這步終止耦合反應。

10. 20mM 乙醇胺重懸珠子并室溫旋轉2 小時。

11. 將珠子2500rpm 離心5 分鐘。

12. PBS 洗珠子2 次。

13. 200mM 甘氨酸洗珠子2 次。

14. PBS 洗珠子2 次。

15. 珠子可以4°C 儲存在PBS + 0.1％ 疊氮鈉溶液里（PBS︰珠=1:1）。

16. 這些珠子可用于IgM 抗體的免疫沉淀實驗。從這里就可以按照我們前面描述的免疫沉淀實驗方法繼續進行免疫沉淀程序了。