Hypoxyprobe Omni試劑盒的應用及測定說明

Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒組分的詳細信息

1) Hypoxyprobe?-1是一種取代的2-硝基咪唑，其化學名稱和唯一成分是pimonidazole鹽酸鹽。Hypoxyprobe?-1的分子量為290.8；水溶性為400毫摩爾，相當于116毫克/毫升；在324納米處有紫外吸收，消光系數為7020，在0.9%的鹽水中。其游離堿，pimonidazole，分子量為254.3，pKa值為8.7，辛醇水分配系數為8.5。

Hypoxyprobe?-1在固體形式和水溶液中化學穩定。例如，固體Hypoxyprobe-1在室溫下昏暗光線中儲存兩年，通過紫外和HPLC分析未檢測到降解。0.9%鹽水中的Hypoxyprobe?-1溶液以100克/升的濃度在4°C下儲存4.5年，未檢測到降解（紫外和HPLC分析）。

Pimonidazole在缺氧細胞中通過還原激活。激活的中間體與蛋白質、肽和氨基酸中的巰基（硫醇）基團形成穩定的共價加合物?？贵w試劑PAb2627AP與這些加合物結合，允許通過免疫化學方法檢測它們。

2) PAb2627AP是一種親和純化的兔抗體制劑，與缺氧細胞中Hypoxyprobe?-1的蛋白質加合物結合。PAb2627AP含有疊氮化鈉以增加穩定性。感興趣的組織可以通過冷凍固定或甲醛固定的石蠟包埋切片的免疫組化；西方印跡法；或在組織解離后的流式細胞術進行研究。

注意：PAb2627AP與缺氧細胞中pimonidazole的蛋白質、肽和氨基酸加合物結合，但組織處理以準備免疫組化測定時會洗去小分子肽和氨基酸加合物，因此免疫組化缺氧檢測依賴于缺氧組織中pimonidazole的蛋白質加合物。

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Hypoxyprobe Omni試劑盒：

應用：通過免疫熒光或免疫過氧化物酶染色、西方印跡法或流式細胞術進行細胞和組織缺氧的免疫化學檢測。當Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒與抗兔二抗試劑（Omni試劑盒中不提供的二抗試劑）結合使用時，在小鼠組織中的背景非常低。

數量：a. Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒包含100毫克、200毫克或1000毫克的Hypoxyprobe?1（pimonidazole HCl）。典型的劑量是小動物研究每公斤體重60毫克，人類研究每公斤體重14毫克。

b. 一盒（100毫克和200毫克試劑盒）或兩盒（1000毫克試劑盒）200微升的親和純化抗pimonidazole兔抗血清，含有0.09%的疊氮化鈉和1%的牛血清白蛋白作為穩定劑。PAb2627AP的最佳稀釋度由每位研究者確定，但發現1/50至1/200的稀釋度在與過氧化物酶標記的山羊抗兔抗血清結合時，對小鼠腫瘤組織進行免疫染色效果強烈。

不提供：抗兔二抗試劑和標準IHC試劑，如緩沖液、底物色素原等。

儲存：a. 將Hypoxyprobe?-1固體存放在室溫下的暗處（也可以存放在28攝氏度）。

b. 將兔PAb2627AP存放在2-8攝氏度。不要冷凍。

測定說明

1. 對正?；蚰[瘤組織缺氧的研究始于靜脈輸注、腹腔注射或口服Hypoxyprobe?-1溶液，動物劑量為每公斤體重60毫克，人類為每公斤體重14毫克。對于一只25克的小鼠，這相當于每只小鼠1.5毫克。在小鼠中已使用高達每公斤體重400毫克的劑量，未檢測到毒性或組織缺氧的變化，但每公斤體重60毫克可在最低成本下獲得良好的免疫染色。Hypoxyprobe?-1在鹽水中的溶解度為116毫克/毫升，因此可以使用非常小的體積來施用Hypoxyprobe?-1。

注射或攝取后，Hypoxyprobe?-1分布到所有組織，包括大腦，但它僅與那些氧氣濃度低于14微摩爾的細胞中的含巰基蛋白質形成加合物——相當于在37°C時的氧分壓pO2 = 10毫米汞柱。除了腫瘤，正常組織如肝臟、腎臟和皮膚也擁有pO2為10毫米汞柱或更低的細胞。這些正常組織會結合Hypoxyprobe?-1。

小鼠體內Hypoxyprobe?-1的血漿半衰期大約為25分鐘。相比之下，大鼠的血漿半衰期為45分鐘，狗為90分鐘，人類為300分鐘。感興趣的小鼠組織可在Hypoxyprobe?-1給藥后15至90分鐘內收獲。收獲時組織中的Hypoxyprobe?-1將在組織缺氧時結合。然而，與組織在15至90分鐘實驗過程中暴露的量相比，殘留的Hypoxyprobe?-1的量非常小，因此由于殘留的Hypoxyprobe?-1引起的任何非特異性結合都是不可檢測的。

除了動物研究，Hypoxyprobe?試劑盒還可用于組織培養中的細胞。通常，細胞懸浮液在缺氧條件下與100至200微摩爾的Hypoxyprobe?-1一起孵育1至2小時。通過細胞旋轉收獲細胞，固定并用PAb2627PA和顯色或熒光二抗進行免疫染色。

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）專注于研發非侵略性的缺氧標志物（Hypoxia maker）和缺氧依賴性的細胞因子，所有產品皆基于Pimonidazole核心結構來開發。 使用Pimonidazole HCl作為缺氧標記物，廣泛用在狗、大小鼠。缺氧探針試劑盒核心組分為：缺氧探針（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探針的抗體。不同試劑盒中的探針和抗體標記不同（可應用于免疫熒光（IF），免疫組化（IHC），WB或流式細胞分析（FC））

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