Hypoxyprobe低氧探針Gemini試劑盒實驗研究及文獻參考

使用Hypoxyprobe Gemini試劑盒通過免疫化學檢測（包括免疫過氧化物酶法、免疫熒光法或流式細胞術）跟蹤單一組織樣本中的缺氧變化。Kleiter等人使用免疫過氧化物酶分析對連續切片進行研究（Kleiter et al., Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 64: 592-602, 2006），而Ljungkvist等人則在同一組織切片上使用雙重缺氧標記的免疫熒光分析（Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62: 1157-1168, 2005）。

Hypoxyprobe低氧探針Gemini試劑盒檢測說明：

雙標記研究在嚙齒動物中開始時，通過靜脈輸注或腹腔注射含有60毫克/公斤體重（約1.5毫克/只小鼠）鹽酸匹莫苯溶液。鹽酸匹莫苯在生理鹽水中的溶解度為116毫克/毫升，因此可以使用非常小的體積。15至90分鐘后，施加改變缺氧程度的干預。隨后，腹腔注射溶解于10% DMSO/90%花生油中的CCI-103F（見Ljungkvist等，國際放射腫瘤生物物理雜志62: 1157-1168，2005），劑量為60毫克/公斤。注射后60至120分鐘，收集目標組織。CCI-103F的60毫克/公斤劑量在摩爾基數上低于鹽酸匹莫苯，但CCI-103F的血漿半衰期較長（t1/2 = 90分鐘，鹽酸匹莫苯在小鼠中的半衰期為25分鐘），從而進行補償。

注射后，Hypoxyprobe?標記物分布到所有組織，但僅在氧濃度低于14微摩爾的細胞中與含硫蛋白、肽和氨基酸形成加合物——相當于37°C下的分壓pO2為10 mm Hg。正常組織如肝臟、腎臟和皮膚中的細胞氧分壓在10 mm Hg或更低，這些組織會與Hypoxyprobe?標記物結合。在采樣時未結合的Hypoxyprobe?標記物在組織中存在時，會在組織解剖時激活并結合，因為解剖后的組織會缺氧。然而，與組織在典型實驗中暴露于的Hypoxyprobe?標記物量相比，殘留的Hypoxyprobe?標記物濃度非常小，因此在組織采樣時任何來自殘留Hypoxyprobe?標記物的非特異性結合都是不可檢測的。

圖示：Gemini試劑盒用于比較口服給藥的吡莫達唑（Pimo，左側面板）和靜脈給藥的CCI-103F（F6，右側面板），在來自腫瘤犬的單個腫瘤活檢的相鄰組織切片中進行分析。Gemini試劑盒中非交叉反應的兔抗血清可獨立評估這兩種標記物的結合（Kleiter等，國際放射腫瘤生物物理雜志64: 592-602，2006）。

建議的協議： 使用雙重缺氧標記物對來自福爾馬林固定石蠟包埋組織的相鄰切片進行免疫過氧化物酶分析。Kleiter等，國際放射腫瘤生物物理雜志64: 592-602，2006。

艾美捷Hypoxyprobe-低氧探針Gemini試劑盒：

貨號：HP5-XXX

規格：

a. Hypoxyprobe? Gemini試劑盒分別包含100、200或1000毫克的缺氧標記物Hypoxyprobe?-1（哌莫尼達唑HCl）和Hypoxyprobe?-6（CCI103F）。通常在小動物研究中使用每個標記物60毫克/千克體重的劑量。

b. 每個試劑盒包含稀釋的親和純化抗哌莫尼達唑和稀釋的抗CCI103F非交叉反應兔抗血清（PAb2627和PAbF6），其中含有0.09%氙化鈉和1%BSA作為穩定劑。100和200毫克的試劑盒各包含一個200微升的抗血清單位；1000毫克的試劑盒包含兩個200微升的抗血清單位?？寡宓淖罴巡僮飨♂尪刃栌裳芯咳藛T確定，但1/500-1/1000的稀釋度在與過氧化物酶偶聯的山羊抗兔次級抗體結合時能提供強的免疫過氧化物酶染色。1/50-1/200的較低稀釋度可能更適合雙重標記的免疫熒光研究（Ljungkvist et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62

: 1157-1168, 2005）。

未提供：抗兔次級試劑或其他免疫組織化學試劑（緩沖液、抗原修復劑等）。

儲存：

a. 將Hypoxyprobe?-1和Hypoxyprobe?-F6在室溫下避光存放（也可存放在2-8攝氏度）。

b. 將兔抗血清（PAb2627和PAbF6）存放在2-8攝氏度。

Hypoxyprobe?-F6試劑盒成分的詳細描述：

1) Hypoxyprobe?-1（吡莫尼達唑鹽酸鹽）和Hypoxyprobe?-F6（CCI-103F）是取代的2-硝基咪唑類化合物。吡莫尼達唑鹽酸鹽的分子量為290.8，水溶性高達400毫摩爾，等于116毫克/毫升。CCI-103F是一種六氟化的2-硝基咪唑，具有六個磁性等效的氟原子，分子量為337.2，水溶性為5.3毫摩爾，等于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10% DMSO/花生油混合物通過腹腔注射給藥（Ljungkvist等，國際放射腫瘤生物物理雜志62: 1157-1168，2005）。吡莫尼達唑和CCI-103F在缺氧細胞中被還原激活，激活的中間體與蛋白質、肽和氨基酸中的巰基（硫醇）基團形成穩定的共價加合物。抗吡莫尼達唑和抗CCI-103F的初級抗血清以非交叉反應的方式結合這些加合物，從而允許通過免疫化學方法進行檢測。

2) 非交叉反應的兔抗血清，能夠結合還原激活的吡莫尼達唑（PAb2627）和CCI-103F（PAbF6）的蛋白加合物，作為稀釋抗血清供應，含有0.09%的疊氮鈉和1%的牛血清白蛋白作為穩定劑。感興趣的組織可以通過免疫組化技術研究福爾馬林固定的石蠟包埋切片或冷凍切片，或者在組織解離后通過流式細胞術，或通過西方印跡法進行研究?？寡迥軌蚪Y合缺氧細胞中吡莫尼達唑或CCI-103F的蛋白、肽和氨基酸加合物，但免疫組化檢測的組織處理會洗掉肽和氨基酸加合物，因此免疫組化檢測僅依賴于缺氧組織中吡莫尼達唑或CCI-103F的蛋白加合物。對連續的福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片進行免疫過氧化物酶分析時，需將組織切片與約1:500稀釋的抗吡莫尼達唑或抗CCI-103F抗血清混合孵育100微升。然后應用一種顯色的山羊抗兔二級抗體，以揭示缺氧標記加合物的分布。以下提供詳細的免疫過氧化物酶協議作為一般指南，但強調Hypoxyprobe?技術穩健，鼓勵研究人員自行進行修改。有關冷凍切片研究，請參見Ljungkvist等，國際放射腫瘤生物物理雜志62: 1157-1168，2005及相關參考文獻。

Hypoxyprobe 致力于為氧代謝紊亂引起的惡性和正常組織疾病提供診斷和治療工具。

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