Hypoxyprobe-Pimonidazole HCl-- 瘤內過氧化氫（KORTUC）注射后的腫瘤再氧化：一種增強放射敏感性的新方法

發布者：艾美捷科技發布時間：2024-10-18

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解析文章《Tumour reoxygenation after intratumoural hydrogen peroxide (KORTUC) injection: a novel approach to enhance radiosensitivity》

作者：

Samantha Nimalasena ^1,2,5 , Selvakumar Anbalagan ^1,5 , Carol Box ¹ , Sheng Yu ¹ , Jessica K. R. Boult ¹ , Nigel Bush ¹ , Louise Howell ³ ,Victoria Sinnett ² , William Murphy ⁴ , John Yarnold ¹ , Simon P. Robinson ¹ and Navita Somaiah ^{1,2 ?}

鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/full/10.1161/CIRCRESAHA.118.314438

一、研究背景

1.腫瘤缺氧與放療抗性

腫瘤缺氧是放療抗性的一個重要原因。自 20 世紀 50 年代 Gray 等人的開創性研究以來，人們一直在尋求增加氧合以提高放療效果的策略。

2.KORTUC 的潛在作用

前期臨床和臨床研究報道了瘤內注射過氧化氫（H?O?）作為實體瘤潛在放療增敏劑的可能性。KORTUC 是將 H?O?與 0.83% 透明質酸鈉凝膠混合制成的 0.5% H?O?溶液，用于體內注射，以確保穩定性并減少注射疼痛。作者所在的 I 期臨床試驗已證實其在局部晚期乳腺癌中的安全性，并顯示出有希望的腫瘤反應。當 H?O?與電離輻射聯合應用于放療抗性細胞系和小鼠腫瘤模型時，觀察到增強的細胞毒性作用和顯著的腫瘤生長延遲，其機制不僅與輻射導致的 DNA 損傷增強有關，還涉及溶酶體膜透化、重金屬離子釋放、線粒體膜破壞和細胞凋亡等。瘤內注射 KORTUC 后，H?O?分解產生水和氧氣，或在亞鐵離子存在下產生氧氣和羥基自由基，氧氣微泡的形成可用于引導藥物在腫瘤內的傳遞，這促使作者研究其是否可通過再氧合作用來增強放療敏感性。

二、研究方法

1.細胞培養

培養人 HCT116 結直腸癌細胞和 LICR - LON - HN5 頭頸部癌細胞，使用 Dulbecco’s modified eagle’s medium 補充 10% 胎牛血清，在特定條件下培養，并通過短串聯重復（STR）分析和 PCR 分析對細胞系進行驗證和支原體檢測。

2.藥物制備

在完全細胞培養基中制備過氧化氫的系列稀釋液（0 - 9.6 mM）。對于瘤內 KORTUC 注射，將 3% v/v 過氧化氫與透明質酸鈉凝膠混合，在無菌條件下制備成最終臨床濃度為 150mM 0.5% v/v 的溶液。

3.Spheroid 實驗

（1）將細胞接種在超低附著 96 孔板中形成球狀體。在第 4 天，用不同濃度的 H?O?處理球狀體。

（2）對于缺氧的免疫組化檢測，球狀體在固定前用 200?M pimonidazole（Hypoxyprobe? - 1，HP - 100）孵育 24h，然后進行一系列處理和染色，包括用抗 pimonidazole 抗體檢測生物還原加合物以及用 DAPI 復染細胞核等，并對球狀體直徑和平均熒光強度進行量化。

（3）對于實時缺氧成像，球狀體用 5?M Image - iT? Red Hypoxia Reagent 孵育 24h，然后用相同濃度范圍的 H?O?處理，在不同時間點獲取明場和熒光圖像。

4.Xenograft 實驗

（1）將腫瘤細胞注射到六周齡雌性 Foxn1 裸鼠皮下，當腫瘤體積達到約 400mm? 時進行處理，將小鼠隨機分為三組：非注射對照組、載體注射對照組（僅透明質酸鈉）和 KORTUC 組（透明質酸鈉 + H?O?）。

（2）瘤內 KORTUC 注射時，小鼠經腹腔注射麻醉，在超聲引導下進行注射，注射后對腫瘤進行不同時間的觀察和處理。

5.Dual hypoxia marker 技術

通過腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）確定基線腫瘤缺氧情況，然后在超聲引導下瘤內注射 KORTUC 或載體，再腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg），最后處死小鼠，獲取腫瘤組織進行一系列處理和染色，包括用不同抗體檢測相關標記物，并進行圖像采集和分析。

6.圖像分析

使用 cellSens 和 Fiji（ImageJ 應用）對圖像進行分析，包括定義和量化缺氧加合物形成，確定再氧合區域，以及對 phospho - ATM 焦點進行量化等。

三、Hypoxyprobe 品牌的 HP - 100 試劑盒產品的作用和價值

產品鏈接：

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/MSDS_HP_2_24.pdf

Substance Name ：Pimonidazole Hydrochloride

Brand Name ：Hypoxyprobe?-1

Company ：Hypoxyprobe, Inc (HPI)

1.在 Spheroid 實驗中的作用

在球狀體缺氧的免疫組化檢測中，使用 Hypoxyprobe? - 1（HP - 100）試劑盒中的 pimonidazole。球狀體在固定前用 200?M pimonidazole 孵育 24h，通過檢測生物還原加合物來確定缺氧情況。這對于研究 H?O?處理對球狀體缺氧的影響至關重要，能夠提供球狀體內部缺氧狀態的準確信息，幫助研究人員了解不同濃度 H?O?處理下球狀體缺氧的變化規律。

2.在 Xenograft 實驗中的作用

在 Dual hypoxia marker 技術中，首先腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）來確定基線腫瘤缺氧情況。然后在瘤內注射操作后，又腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg）來進一步檢測腫瘤缺氧的變化。這些操作能夠全面、準確地評估瘤內注射 KORTUC 前后腫瘤缺氧狀態的改變，為研究腫瘤再氧合機制提供了關鍵的數據支持。

Hypoxyprobe? F6 Kit

(HPI Catalog # HP4-XXX)

Kit contents:

Solid CCI-103F (Hypoxyprobe?-F6)

Diluted Rabbit anti-CCI-103F antisera (PAbF6)

應用: 使用Hypoxyprobe?-F6 Kit通過免疫化學檢測（包括免疫過氧化物酶、免疫熒光或流式細胞術）測量組織和細胞中的缺氧。

3.總體價值

Hypoxyprobe 品牌的相關試劑盒產品為研究腫瘤缺氧和再氧合提供了有效的工具。通過使用這些試劑盒中的試劑，可以準確地標記和檢測腫瘤組織及球狀體中的缺氧區域，使得研究人員能夠定量分析缺氧程度的變化，對于深入了解 KORTUC 對腫瘤缺氧的影響以及其放療增敏機制具有不可替代的價值。

四、實驗結果

1.H?O?誘導的再氧合在 3D 球狀體模型中呈劑量和時間依賴性

Pimonidazole 加合物形成證實了 HCT116 和 HN5 球狀體模型中存在缺氧。Image - iT? Red 熒光在 H?O?處理后 1h 呈劑量依賴性降低，在 [H?O?]≥1.2 mM 時顯著，與球狀體再氧合一致。在 HCT116 球狀體中，缺氧降低可持續到處理后 6h（≥2.4 mM H?O?），但在 24h 時熒光重新出現，表明缺氧再次出現。H?O?處理 24h 后對球狀體進行 pimonidazole 加合物染色也進一步證實了球狀體再氧合，且在 [H?O?]>1.2 mM 時觀察到該效果。

2.超聲成像證實瘤內 KORTUC 注射后 O?持續釋放

在臨床和實驗中，瘤內注射 KORTUC 后會立即形成氧氣微泡，在異種移植模型中也觀察到了這種現象。對 HCT116 腫瘤的超聲成像顯示，氧氣微泡的回聲性逐漸降低，但在注射后可持續 1h，而注射透明質酸鈉時未觀察到微泡形成，證實瘤內 H?O?可導致氧氣微泡持續釋放。

3.瘤內 KORTUC 顯著降低 HCT116 和 HN5 異種移植物的腫瘤缺氧

通過對 CCI - 103F 和 pimonidazole 加合物形成的量化，發現瘤內 KORTUC 注射導致兩種異種移植物模型中的腫瘤缺氧顯著降低，與載體或非注射對照組相比，差異顯著。而注射透明質酸鈉的腫瘤缺氧降低不顯著。

4.KORTUC 治療導致 phospho - ATM 焦點增加，提示再氧合和 ROS 增加

在 HCT116 異種移植物中，對 phospho - ATM 焦點進行評分，發現 KORTUC 注射組中 > 5 phospho - ATM 焦點的細胞顯著多于對照組。在 CCI - 103F 陽性和陰性細胞中均有此現象，推測 CCI - 103F 陽性細胞中增加的 phospho - ATM 表達可能是由于 ROS 和 / 或再氧合誘導的 ROS 的共同作用，而 CCI - 103F 陰性細胞中可能是由于 ROS 單獨作用。