Hypoxyprobe/艾美捷Hypoxyprobe-1 Plus Kit的應用及檢測步驟

Hypoxyprobe-1是一種取代的2-硝基咪唑，其化學名稱為吡默尼達唑鹽酸鹽，分子量為290.8；水溶性為400毫摩爾（116 mg/ml）；在324 nm波長處的紫外吸收（0.9%生理鹽水中消光系數為7020）。游離堿基吡默尼達唑的分子量為254.3，pKa為8.7，辛醇-水分配系數為8.5。

固體Hypoxyprobe-1在柔和光照下室溫保存了兩年，并在4°C的0.9%生理鹽水（100 g/l）中保存了4.5年，沒有檢測到降解（紫外線和HPLC分析）。

吡默尼達唑在缺氧細胞中被還原活化，并與蛋白質、肽和氨基酸中的硫醇（巰基）基團形成穩定的加合物。FITC-MAb1與這些加合物結合，從而實現免疫化學檢測。

FITC-MAb1是一種熒光素標記的抗吡默尼達唑大鼠IgG1單克隆抗體（MAb克隆11.23.22.R），濃度為0.5 mg/ml，溶于含有0.09%穩定劑proclin的PBS中。感興趣的組織可以通過在冷凍固定切片或福爾馬林固定的石蠟包埋切片上進行免疫組化，或通過組織解離后的流式細胞術進行研究。

注意：FITC-MAb1與吡默尼達唑的蛋白質、肽和氨基酸加合物結合，但在免疫組化過程中，組織處理會洗去肽和氨基酸加合物，因此免疫組化缺氧檢測依賴于缺氧組織中吡默尼達唑的蛋白質加合物。

染色的抗FITC二級試劑是一種親和純化的兔IgG多克隆抗體，與辣根過氧化物酶結合，專為Hypoxyprobe, Inc.制備。過氧化物酶標記的抗FITC二級試劑在福爾馬林固定、石蠟包埋的大鼠腫瘤組織中提供強烈的免疫染色，并且背景信號非常低。

艾美捷Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Plus Kit（HP2-XXX）：

應用：用于細胞和組織缺氧的免疫化學檢測，包括免疫熒光、免疫過氧化物酶法或流式細胞術。當將Hypoxyprobe-1 Plus Kit與抗FITC二級試劑結合使用時，來自大鼠組織的天然綠色熒光蛋白（通常會干擾缺氧信號）產生的背景信號非常低。

數量：

a. 三種不同規格的Hypoxyprobe-1 Plus Kit分別含有100 mg、200 mg或1000 mg的吡默尼達唑鹽酸鹽。每千克體重60 mg的劑量足以用于動物研究。

b. 三種不同規格的Hypoxyprobe-1 Plus Kit還包含一個瓶（100 mg和200 mg Kit）或兩個瓶（1000 mg Kit），每瓶含有200微升抗吡默尼達唑的FITC標記的IgG1大鼠單克隆抗體（克隆11.23.22.R）。每瓶含有200微升濃度為0.50 mg/ml的FITC-MAb1溶液，溶于含有1% BSA和0.09%疊氮化鈉的PBS中。FITC-MAb1的最佳稀釋度由研究人員確定，但在與1:50-100稀釋的過氧化物酶標記的抗FITC二級試劑結合使用時，1:50-100的稀釋度在大鼠腫瘤組織中能夠產生強烈的免疫染色。雖然FITC-MAb1并非專為免疫熒光設計，但也可用于此目的。通常，免疫熒光的抗體稀釋度低于免疫過氧化物酶檢測的稀釋度。

不提供：用于免疫組織化學分析的標準試劑。

儲存：

a. 將Hypoxyprobe-1固體在室溫下避光保存（也可存放在2-8°C）。

b. 將FITC-MAb1和HRP標記的兔抗FITC在2-8°C避光保存。不可冷凍。

Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Plus Kit檢測步驟：

1、正?；蚰[瘤組織缺氧的研究開始于通過靜脈注射、腹腔注射或口服給予60 mg/kg體重的Hypoxyprobe-1（吡默尼達唑鹽酸鹽）溶液。對于一只25克的大鼠，這相當于1.5 mg/只。在小鼠中使用高達400 mg/kg的劑量也未發現毒性或組織缺氧的變化，但60 mg/kg的劑量可在最低成本下獲得良好的免疫染色。

2、Hypoxyprobe-1在生理鹽水中的溶解度為116 mg/ml，因此可以使用非常小的體積來給予Hypoxyprobe-1。注射或攝入后，吡默尼達唑分布到包括大腦在內的所有組織，但僅在氧濃度低于14微摩爾的細胞中與含硫蛋白形成加合物——相當于37°C下的部分壓力pO2 = 10 mm Hg。除了腫瘤外，肝臟、腎臟和皮膚等正常組織中也存在pO2 = 10 mmHg時的細胞。這些正常組織會與Hypoxyprobe-1結合。

3、Hypoxyprobe-1在小鼠中的血漿半衰期約為25分鐘（有關參考信息，請見www.hypoxyprobe.com上的FAQ鏈接）。作為比較，大鼠的血漿半衰期為45分鐘，犬為90分鐘，人類為300分鐘。在給予Hypoxyprobe-1后15至90分鐘內可以采集感興趣的大鼠組織。在采集時，組織中存在的Hypoxyprobe-1將在解剖組織缺氧時被結合，但與在15至90分鐘實驗中組織暴露的Hypoxyprobe-1量相比，殘留的Hypoxyprobe-1量非常小，因此由于殘留的Hypoxyprobe-1引起的非特異性結合是不可檢測的。

圖.福爾馬林固定的吡嘧達唑結合的免疫過氧化物酶染色

使用1:100稀釋度的FITCMAb1和1:100稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的兔抗FITC IgG從嚙齒動物腫瘤中切下石蠟包埋組織切片。

Hypoxyprobe 致力于為氧代謝紊亂引起的惡性和正常組織疾病提供診斷和治療工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。