Hypoxyprobe：Hypoxyprobe Omni Kit 試劑盒

解析文章《Real-Time Assessment of Tissue Hypoxia In Vivo with Combined Photoacoustics and High-Frequency Ultrasound》

作者：

Marco Gerling ^1* , Ying Zhao ^2,3* , Salvatore Nania ³ , K. Jessica Norberg ³ , Caroline S. Verbeke ⁴ , Benjamin Englert ¹ , Raoul V. Kuiper ⁶ , ?sa Bergstr?m ¹ , Moustapha Hassan ⁵ , Albrecht Neesse ⁷ , J. Matthias L?hr ^1,3 , Rainer L. Heuchel ^1,3 *

鏈接：

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3982131/

背景

在癌癥研究中，非侵入性功能成像已成為評估腫瘤發展和治療效果的重要工具。腫瘤缺氧與腫瘤的侵襲性和預后密切相關，是監測癌癥進展的關鍵參數之一。近年來，光聲（Photoacoustic, PA）成像技術因其能夠結合高頻率超聲（Ultrasound, US）實現解剖學和功能性信息的并行收集，逐漸在臨床前研究中展現出應用潛力。光聲成像通過激光脈沖激發分子產生熱彈性波，這些波可以被超聲接收器檢測，從而實現對深層組織內光吸收分子的高分辨率成像。

方法

實驗設計

本研究采用了一種新型的雙模態PA/US系統，旨在測試雙波長PA測量相對組織氧合度的可行性和可靠性。研究團隊在小鼠胰腺癌和結腸癌模型上進行了成像，并將組織氧合度的差異與相應組織區域的免疫組化缺氧染色進行了比較。

Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒的應用

在實驗中，為了可視化缺氧區域，研究團隊使用了Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒（Hypoxyprobe Inc.生產，貨號：HP3）。該試劑盒包含Pimonidazole HCl和親和純化的兔抗Pimonidazole抗體（PAb2627AP）。Pimonidazole是一種乏氧細胞標記物，能夠在缺氧條件下與細胞內蛋白質結合，形成穩定的加合物。通過腹腔注射Pimonidazole后，可以使用PAb2627AP抗體進行免疫組化染色，從而可視化組織中的缺氧區域。

具體實驗步驟

腫瘤模型建立：研究團隊使用了小鼠胰腺癌（KPC細胞系）和結腸癌（通過AOM和DSS誘導）模型。

成像與數據采集：使用VisualSonics Vevo 2100 LAZR成像系統對小鼠進行PA和B模式US成像。在PA成像中，采用750 nm和850 nm的雙波長激光脈沖，測量氧合血紅蛋白（HbO?）和脫氧血紅蛋白（Hb）的濃度，進而計算組織氧飽和度（sO?）。在成像前，通過腹腔注射Pimonidazole，隨后在成像后進行免疫組化分析，以驗證PA成像結果的準確性。

免疫組化分析：切除腫瘤組織，用4%甲醛固定過夜，并進行石蠟包埋切片。

使用PAb2627AP抗體進行免疫組化染色，檢測Pimonidazole與缺氧細胞內蛋白質的加合物。使用ImageJ軟件量化棕色染色強度，以評估缺氧程度。

實驗結果

實時光聲成像檢測小鼠器官氧合度變化

通過改變小鼠的氧氣供應，研究團隊證明了PA系統能夠實時檢測組織氧合度的變化。當氧氣供應從醫用空氣（21% O?）增加到純氧（100% O?）時，PA成像顯示肝臟實質和胃壁的氧合度均有所增加，且肝臟實質的氧合度增加更為迅速和顯著。當氧氣供應恢復到醫用空氣時，氧合度也隨之恢復正常。

腫瘤缺氧檢測及與組織學評估的相關性

在胰腺癌和結腸癌模型中，PA成像能夠準確識別缺氧區域，并與免疫組化染色結果高度一致。例如，在胰腺癌模型中，PA成像能夠清晰顯示腫瘤內的缺氧區域，而免疫組化染色也證實了這些區域的缺氧狀態。通過線性回歸分析，研究團隊發現PA測量的氧飽和度與Pimonidazole染色強度之間存在顯著的正相關關系（r?=0.91, p=0.0028）。

光聲成像與靜脈造影的互補性

為了評估腫瘤灌注情況，研究團隊在PA成像的基礎上結合了靜脈造影。通過靜脈注射微泡造影劑，并實時跟蹤其在腫瘤內的分布和清除情況，研究團隊能夠同時獲取腫瘤的氧合度、灌注情況和解剖結構信息。這種雙模態成像方法為縱向實時監測腫瘤血管生成和治療反應提供了有力的工具。

胰腺皮下腫瘤異種移植物腫瘤缺氧的評價。A)缺氧s.c腫瘤的典型氧-血紅蛋白PA圖像。b模式圖像（左圖）和氧飽和度圖（氧- hemo PA成像，右圖）并排放置，顯示相同的成像窗口。熱圖表示氧飽和度水平，范圍從100%（紅色）到0%（深藍色）。低于總Hb定義閾值（最大強度的20%）的斑點為黑色（見方法）。黃線代表腫瘤區域。B)同一s.c.腫瘤的代表性缺氧染色（棕色）。黑線表示腫瘤區域。C)圖2A所示缺氧s.c腫瘤的代表性H&E染色。D)非缺氧性s.c腫瘤的典型氧血紅蛋白圖像。b模式圖像和氧飽和度圖

（氧合血紅光聲圖像放置在右側顯示相同的成像窗口）。熱圖如上所示。黃線代表腫瘤區域。E)非缺氧s.c腫瘤的代表性吡莫硝唑染色，因此缺乏棕色染色，如圖2D所示。黑線表示腫瘤區域。F)具有代表性的非缺氧性sc腫瘤的H&E染色。G)基于pa的so2測量和相應的吡硝唑染色強度線性回歸分析的圖形表示。將吡莫硝唑強度歸一化，將數據集中的最高值調整為100，將最低強度設置為0。95%置信區間的置信帶如圖（虛線）所示。

結論

本研究表明，雙波長PA成像技術能夠實時、可靠地檢測小鼠腫瘤模型中的缺氧區域，并與免疫組化結果高度一致。通過結合B模式US和靜脈造影技術，該方法還能夠提供關于腫瘤灌注和解剖結構的詳細信息。因此，雙模態PA/US成像技術在臨床前癌癥研究中具有廣泛的應用前景，可用于實時監測腫瘤生長和治療反應。

Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒的作用和價值

(HP Catalog # HP3)

產品鏈接：

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/HP3-Hypoxyprobe-Omni-Kit-Insert-2020.pdf

在本研究中，Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒發揮了至關重要的作用。該試劑盒提供了一種簡便、可靠的方法來可視化組織中的缺氧區域。通過結合Pimonidazole和PAb2627AP抗體進行免疫組化染色，研究團隊能夠準確評估腫瘤的缺氧狀態。這種方法不僅適用于小鼠模型，還具有潛在的臨床應用價值。此外，該試劑盒的易用性和高靈敏度也使得它成為研究腫瘤缺氧的理想工具之一。

討論

隨著基因工程小鼠模型的不斷發展和新興藥物靶點的多樣性增加，對臨床前成像和縱向監測治療反應的需求也日益增長。PA成像技術作為一種非侵入性功能成像方法，能夠利用內源性對比劑（如血紅蛋白）進行成像，并與外源性對比劑相結合以拓寬其應用范圍。本研究通過結合PA和US技術，實現了對腫瘤氧合度、灌注和解剖結構的實時、多模態成像，為臨床前癌癥研究提供了一種強大的工具。

此外，PA成像技術還具有廣泛的臨床應用前景。例如，在內窺鏡超聲與PA成像的結合中，可以實現對消化道腫瘤的實時評估；在黑色素瘤的侵襲和轉移研究中，可以利用黑色素作為內源性對比劑進行成像。隨著靶向外源性對比劑的不斷開發和應用，PA成像技術將在未來發揮更加重要的作用。

展望

本研究為實時評估組織缺氧提供了一種新的方法，并展示了PA/US雙模態成像技術在臨床前癌癥研究中的應用潛力。隨著技術的不斷發展和完善，該方法有望在未來得到更廣泛的應用和推廣。同時，Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒作為一種可靠、高效的缺氧檢測工具，也將在腫瘤缺氧研究中發揮越來越重要的作用。