KEAP1-NRF2相互作用的小分子抑制劑篩選

核因子紅細胞2相關因子（Nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）是一種轉錄因子，通過與抗氧化應答元件（antioxidant response element，ARE）區域的啟動子結合，增加抗氧化蛋白的表達，從而協調抗氧化和抗炎反應。在基礎條件下，Nrf2被細胞骨架的Kelch樣ECH關聯蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）保留在細胞質中，并促進Nrf2的泛素化和降解。正常情況下，人體內氧化和抗氧化體系基本處于動態平衡。一旦平衡被打破，機體處于過度氧化負荷下抗氧化物質耗竭或活性下降，則過多的活性氧自由基就可能攻擊靶器官造成組織器官和生物大分子如DNA、RNA、蛋白質、脂質的損傷。一般情況下，Nrf2定位于細胞質，并與Keap1相互作用，泛素化后被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當細胞受到氧化應激時，Keap1蛋白域的結構發生變化，導致Nrf2從Keap1中釋放出來，導致Nrf2蛋白不能被降解從而進入細胞核，結合到ARE上，并誘導抗氧化應答基因的轉錄表達，保護細胞免受氧化損傷。研究表明，運用小分子抑制劑直接阻斷KEAP1-NRF2蛋白-蛋白相互作用可調節抗氧化基因的表達，預防正常細胞惡變，發揮抗癌作用，

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Keap1-Nrf2抑制劑篩選試劑盒旨在利用熒光偏振（fluorescence polarization，FP）技術，通過監測熒光標記分子與配體結合時的旋轉運動性變化，來鑒定Keap1-Nrf2結合抑制劑。FP是一種用于研究分子相互作用的強大工具。該試劑盒包含足夠量的純化Keap1蛋白、熒光標記Nrf2肽和用于100個結合反應的試劑緩沖液。為了確定抑制劑對Keap1-Nrf2復合物形成的影響，將Keap1蛋白和熒光Nrf2肽與或不與測試抑制劑一起孵育30分鐘。使用能夠測量熒光偏振的多功能微孔酶標儀測量Nrf2肽的旋轉運動性變化。

結果賞析：

左圖：Keap1與Nrf2的結合。右圖：Nrf2抑制劑抑制Keap1-Nrf2結合。 結合情況使用Keap1:Nrf2抑制劑篩選試劑盒（BPS Bioscience #72020）進行檢測。Nrf2抑制劑KI696與Nrf2肽和Keap1在逐漸增加的濃度下孵育。熒光偏振度在λex 485nm，λem 530 nm下使用熒光偏振的多功能微孔酶標儀測量。   

文獻案例：

在這項研究中，報道了一種新的6-shogaol衍生物（shogaol噻吩化合物（STC）），通過多種機制（KEAP1獨立和依賴）改善了其NRF2活性，降低了與巰基的反應性（可能改善了其生物作用的選擇性并減少了毒性），并在肝臟微粒體中具有代謝穩定性。使用可重復使用的催化劑（脯氨酸-脯氨酸二肽）采用新的合成方法，在良好的產率（>85%）和純度（~95%）下合成了STC。STC具有良好的藥物樣性質和生物活性，優于6-shogaol。與6-shogaol相比，STC表現出更顯著的抗炎作用，通過NRF2依賴和NRF2非依賴機制（未來的研究應進一步闡明這一方面）。在該研究中，他們就是用的BPS Bioscience Keap1-Nrf2相互作用的抑制劑篩選試劑盒來確定STC在抑制KEAP1-NRF2相互作用方面的效果的。

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