Keap1：Nrf2抑制劑篩選檢測試劑盒：高通量抗氧化通路調節劑篩選工具

氧化應激與炎癥反應是多種慢性疾?。òㄉ窠浲诵行约膊?、心血管疾病、糖尿病及癌癥）的核心病理機制之一。在細胞對抗氧化應激的過程中，轉錄因子Nrf2（核因子紅細胞2相關因子2）發揮著關鍵的“主調節器”作用。正常情況下，Nrf2在細胞質中被Keap1（Kelch樣ECH關聯蛋白1）結合并錨定，Keap1作為E3泛素連接酶復合物的底物識別亞基，持續介導Nrf2的泛素化降解，使其維持在較低水平。當細胞暴露于氧化應激或親電試劑時，Keap1的關鍵半胱氨酸殘基被修飾，構象發生變化，導致Nrf2從Keap1上釋放并轉位進入細胞核。入核后的Nrf2與ARE（抗氧化反應元件）結合，啟動一系列抗氧化蛋白和II相解毒酶（如HO-1、NQO1、GCLC等）的表達，從而保護細胞免受氧化損傷。

鑒于Nrf2/Keap1信號軸在細胞保護中的核心地位，該通路已成為藥物發現的明星靶點。激活Nrf2（通過破壞Keap1-Nrf2相互作用）可用于治療以氧化應激為特征的疾病，如慢性腎病、慢性阻塞性肺病、多發性硬化癥等；而在某些癌細胞中，Nrf2的持續激活則促進腫瘤存活和化療耐藥，此時恢復Keap1功能或抑制Nrf2則成為治療策略。因此，篩選能夠阻斷Keap1與Nrf2結合的小分子抑制劑，對于開發新型抗氧化藥物或輔助化療增敏劑均具有重要意義。

由艾美捷代理BPS Bioscience推出的Keap1:Nrf2 Inhibitor Screening Assay Kit（貨號：72020），正是為滿足上述需求而設計的一套完整熒光偏振（Fluorescence Polarization, FP）檢測方案。該試劑盒采用96孔板格式，通過監測熒光標記Nrf2肽段與Keap1蛋白結合后旋轉運動性的變化，快速、定量地評估化合物對Keap1:Nrf2相互作用的阻斷能力，適用于高通量篩選及IC??測定。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程、應用場景及性能特點等方面進行詳細介紹。

圖1. Keap1:Nrf2抑制劑篩選檢測試劑盒示意圖。

一、檢測原理：熒光偏振法監測蛋白-肽段相互作用

熒光偏振是一種基于分子旋轉運動性變化來研究分子間相互作用的經典技術，具有均相、無需分離、實時檢測等突出優勢。其核心原理如下：

當一個小分子熒光團（如熒光素）被偏振光激發時，發射光的偏振程度與其在激發態壽命內的旋轉速度密切相關。小分子物質（如自由的熒光標記肽段）旋轉速度快，發射光偏振度低；而大分子復合物（如熒光肽段與較大的Keap1蛋白結合后）旋轉速度顯著減慢，發射光偏振度升高。偏振值通常以毫偏單位（mP）表示。

在本試劑盒中：

熒光標記的Nrf2肽段：該肽段包含Nrf2與Keap1結合所必需的核心基序——ETGE基序，其C端或N端共價連接熒光基團（如FAM）。該肽段分子量較?。s2–3 kDa），自由狀態時偏振值較低。

Keap1蛋白：重組人源Keap1蛋白（包含其Kelch結構域，該結構域負責識別Nrf2的ETGE基序）。Keap1分子量約為70 kDa（全長）或Kelch結構域約35 kDa，遠大于熒光肽段。

結合反應：當熒光Nrf2肽段與Keap1蛋白結合后，形成分子量約為肽段+Keap1的復合物，旋轉速度下降，熒光偏振值顯著升高（通常從約50 mP上升至150–200 mP）。

抑制劑效應：若待測化合物能夠阻斷Keap1與Nrf2肽段的相互作用，則熒光肽段無法被Keap1捕獲，保持自由狀態，偏振值維持在較低水平。通過比較加抑制劑前后偏振值的變化，即可計算抑制率。

這一檢測模式直接評估化合物對蛋白-蛋白相互作用的破壞能力，而非間接測量下游功能變化，因此具有高特異性、高靈敏度及良好的可重復性，非常適合作為先導化合物篩選的主要方法。

二、試劑盒組分與規格

該試劑盒為96孔板格式，包含足夠進行100次結合反應的全部核心組分：

純化的Keap1蛋白：重組人源Keap1，通常為全長或包含Kelch結構域的活性片段，經質控驗證具有Nrf2肽段結合活性。

熒光標記的Nrf2肽段：包含ETGE基序，熒光基團為FAM（激發/發射約485/535 nm），避光保存。

檢測緩沖液：經優化的緩沖體系（含適當鹽濃度、pH穩定劑及去垢劑），以維持蛋白穩定性并降低非特異性結合。

詳細操作說明書：包含蛋白和肽段的推薦工作濃度、稀釋方法及數據分析模板。

所有組分在收貨后按指示存儲（通常為-80°C），自收貨之日起6個月內保持最佳性能。熒光肽段對光敏感，需避光保存并避免反復凍融。

三、實驗流程簡要說明

以下為典型96孔板單次反應的操作步驟（半面積板或常規板均可）：

1. 試劑準備

從-80°C取出Keap1蛋白、熒光Nrf2肽段和檢測緩沖液，置于冰上解凍。

平衡檢測緩沖液至室溫。熒光肽段解凍后短暫離心，置于冰上避光保存。

準備待測抑制劑：用DMSO或檢測緩沖液稀釋至所需濃度（建議設置10個濃度梯度，3倍或2倍倍比稀釋）。

2. 反應體系構建（每孔總體積50–100 μL，以說明書為準）

加入檢測緩沖液補足體積。

加入熒光Nrf2肽段至終濃度（通常為5–20 nM）。

加入待測抑制劑或對照（空白對照為緩沖液，陰性對照為DMSO，陽性對照可使用已知Keap1-Nrf2抑制劑如ML385或KI696等，但需用戶自備）。

加入Keap1蛋白至終濃度（通常為50–200 nM，需預實驗確定EC??濃度）。

推薦先混合肽段和抑制劑，最后加入Keap1啟動反應。

3. 孵育與讀數

用封板膜覆蓋96孔板，室溫避光孵育30–60分鐘，使反應達到平衡。

使用具備熒光偏振檢測模塊的酶標儀，設定激發波長485 nm，發射波長535 nm。分別讀取平行偏振（S）和垂直偏振（P）信號。

計算每孔的偏振值（mP）：  

四、存儲穩定性與運輸條件

試劑盒采用-80°C干冰運輸。收貨后，Keap1蛋白和熒光肽段應立即存放于-80°C，檢測緩沖液可于-20°C或4°C短期保存。熒光肽段需嚴格避光。建議將蛋白和肽段分裝為單次使用量，避免反復凍融。在正確存儲條件下，所有組分自收貨之日起6個月內性能穩定。

五、文獻參考

Inoyama, D., et al. 2012. J. Biomol. Screening 17(4): 435-447