FAP熒光檢測試劑盒：酶動力學與藥物發現實時檢測方案

在腫瘤微環境研究中，成纖維細胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）正成為一個備受關注的治療靶點。FAP是一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶，屬于二肽基肽酶（DPP）亞家族，在正常成人組織中表達極低，但在多種實體瘤（包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌）的癌相關成纖維細胞（CAF）表面顯著上調。FAP通過切割PEDF、血管生成素-1和VEGF-C等基質蛋白，同時上調TGF-β，從而塑造免疫抑制性微環境，促進腫瘤侵襲和轉移。研究表明，敲除FAP可減少胰腺導管腺癌的轉移。此外，FAP獨特的表達譜使其成為小分子抑制劑和CAR-T細胞療法的理想靶點，多項臨床前及臨床試驗正在進行中。因此，開發能夠高效檢測FAP蛋白酶活性并篩選其抑制劑的工具，對于抗腫瘤藥物發現至關重要。

由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的FAP Fluorogenic Assay Kit（貨號：80210），正是為滿足上述需求而設計的一套完整熒光檢測解決方案。該試劑盒采用熒光底物法，可快速、靈敏地定量FAP的蛋白酶活性，適用于酶動力學研究、小分子抑制劑篩選及高通量篩選（HTS）。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程、應用場景及性能特點等方面進行詳細介紹。

圖1：測定原理示意圖。

熒光DPP底物1是一種熒光肽底物（Ala-Pro-AMC二肽）。在共軛形式下，熒光染料AMC發出的能量被猝滅。蛋白水解作用會釋放AMC并發出熒光。熒光的增加與FAP活性直接成正比。

一、檢測原理：熒光底物法實時監測蛋白酶活性

本試劑盒的核心檢測原理基于熒光共振能量轉移（FRET）或直接熒光釋放機制：

熒光底物：試劑盒提供一種針對DPP家族（尤其是FAP）優化的熒光底物。該底物由一個短肽序列（通常為Z-Gly-Pro-AMC或類似結構）共價連接熒光基團（如7-氨基-4-甲基香豆素，AMC）組成。在天然狀態下，肽段與熒光基團的連接導致熒光淬滅或發射波長偏移。

酶切反應：當加入含有FAP的樣品后，FAP特異性切割肽段中脯氨酸之后的酰胺鍵，釋放出游離的熒光基團AMC。

熒光檢測：游離AMC在激發波長約380 nm、發射波長約460 nm處產生強烈的熒光信號。熒光強度隨時間線性增加，其速率（RFU/min）直接反映FAP的蛋白酶活性。

抑制劑評估：若體系中加入FAP抑制劑，酶活性被抑制，熒光生成速率下降。通過對比抑制劑組與對照組（DMSO或無抑制劑）的初始速率，計算抑制率及IC??。

這一檢測模式具有以下技術優勢：均相（無需分離步驟）、實時（可動態監測反應進程）、高靈敏度（檢測下限可達納摩爾級）以及高通量兼容（96孔板格式適配自動化酶標儀）。

二、試劑盒組分與規格

該試劑盒為96孔板格式，包含足夠進行100次酶反應的全部核心組分：

重組人FAP酶（氨基酸29-760）：包含完整的胞外催化結構域，經純化及活性驗證，確保批次間一致性。

DPP熒光底物：即用型溶液，對光敏感，需避光保存。

DPP檢測緩沖液：經優化的pH及離子強度，維持FAP的最佳催化活性。

詳細操作說明書：包含推薦的反應體系、酶稀釋方案及數據分析方法。

所有組分在收貨后按指示存儲（建議-80°C），自收貨之日起6個月內保持最佳性能。熒光底物應避免反復凍融及長時間光照，建議分裝后于-20°C避光保存。

三、應用場景

本試劑盒主要面向以下三類核心應用：

1. 小分子抑制劑的篩選與IC50測定

在抗腫瘤藥物發現項目中，研究者可使用該試劑盒對化合物庫進行高通量篩選，快速識別具有FAP抑制活性的先導化合物。由于檢測體系簡單、成本適中，適合作為初篩方法。對于陽性化合物，可進一步進行劑量-響應曲線分析，獲得IC??值，用于構效關系研究。

2. 酶動力學研究

通過改變底物濃度（固定酶量）測定不同條件下的反應速率，可計算FAP的米氏常數和最大反應速率。同樣，改變酶濃度可驗證線性范圍。這些參數對于理解FAP的催化機制及不同突變體的功能差異具有重要意義。

3. 抗體或生物制劑的阻斷活性評價

除小分子外，該試劑盒也可用于評估抗FAP抗體或基于蛋白質的抑制劑是否能夠阻斷FAP的蛋白酶活性。只需將抗體與FAP預孵育，然后按標準流程加入底物即可。

四、性能特點與注意事項

線性范圍：在優化的酶濃度（如1 nM FAP）和底物濃度下，反應可在30–60分鐘內保持線性，確保速率計算的準確性。

Z'因子：在384孔板格式（若用戶自行轉換）下，該檢測體系通常Z' > 0.6，適合高通量篩選。

背景控制：設置無酶對照孔以扣除底物自發水解產生的背景熒光。同時建議設置無底物對照，評估樣品自身熒光。

抑制劑干擾排除：某些化合物可能在380/460 nm處有自發熒光或吸收，導致假陽性/假陰性。建議設置“抑制劑+底物（無酶）”對照，并在數據分析時進行校正。

底物特異性：該試劑盒使用的DPP底物可被FAP以及同家族成員DPP4、DPP8、DPP9等切割。若需驗證抑制劑的FAP選擇性，建議使用重組單一酶進行平行比較。

五、存儲穩定性與運輸條件

試劑盒采用-80°C干冰運輸。收貨后，FAP酶和熒光底物應立即存放于-80°C，檢測緩沖液可于-20°C或4°C短期保存（以說明書為準）。避免反復凍融：建議將酶分裝為單次使用量（例如10 uL/管），底物按需分裝。在正確存儲條件下，所有組分自收貨之日起6個月內性能穩定。

六、文獻參考

Pure E. and Blomberg R., 2018, Oncogene 37: 4343-4357.

Bughda R., et al., 2021, Immunotargets Ther. 10:313-323.