CDK9/CyclinT激酶檢測試劑盒：支持IC50測定及酶動力學研究

在腫瘤生物學研究中，轉錄失調是驅動癌細胞增殖和耐藥的關鍵機制之一。CDK9（周期蛋白依賴性激酶9）作為正性轉錄延伸因子b（P-TEFb）復合物的催化亞基，與周期蛋白CyclinT共同調控RNA聚合酶II的C端結構域磷酸化，從而控制基因轉錄延伸過程。多種癌基因（如MYC、雄激素受體AR等）的轉錄高度依賴CDK9-CyclinT復合物的活性。CDK9的過度活化與腫瘤發生及治療耐藥密切相關，因此靶向CDK9-CyclinT已成為抗癌藥物開發的熱點方向。近年來，除了傳統小分子抑制劑，靶向蛋白降解（PROTAC）技術也取得了突破——例如選擇性CDK9-CyclinT降解劑LL-K9-3在22RV1細胞中顯示出比親本抑制劑SNS032及PROTAC分子Thal-SNS032更強的降AR和cMyc效果。這些進展凸顯了可靠、高效的CDK9激酶活性檢測方法在藥物發現中的重要性。

艾美捷代理BPS Bioscience推出的CDK9/CyclinT Kinase Assay Kit（貨號：79628），正是為滿足激酶抑制劑篩選和酶動力學研究需求而設計的一套完整發光法檢測方案。該試劑盒采用Kinase-Glo Max作為檢測試劑，通過定量反應后剩余ATP的含量來反映激酶活性，具有操作簡便、靈敏度高、動態范圍寬及高通量兼容等突出優勢。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程、應用場景及性能特點等方面進行詳細介紹。

一、檢測原理：基于ATP消耗的發光法定量激酶活性

本試劑盒的核心檢測原理為“激酶反應-剩余ATP檢測”偶聯法：

激酶反應：在含有重組人源CDK9/CyclinT復合物、特定激酶底物（如組蛋白或合成肽段）及ATP的反應體系中，CDK9/CyclinT催化底物磷酸化，同時將ATP轉化為ADP。反應過程中ATP被持續消耗。

終止與檢測：反應進行一定時間后，加入Kinase-Glo Max發光試劑。該試劑含有熱穩定性熒光素酶及其底物熒光素。當體系中存在剩余ATP時，熒光素酶催化熒光素氧化產生穩定發光信號。發光強度與ATP剩余量呈正比，與激酶活性呈反比。

信號轉換：在無激酶或激酶被完全抑制的情況下，ATP消耗最少，發光信號最高；反之，激酶活性越強，ATP消耗越多，發光信號越低。通過比較待測樣品孔與對照孔的發光值，即可計算激酶活性或抑制率。

這一檢測模式具有以下技術優勢：均相（無需分離磷酸化產物）、高靈敏度（檢測低至亞微摩爾ATP）、寬動態范圍（超過4個數量級）以及操作簡便（僅需“混合-孵育-讀數”三步）。與傳統放射性同位素法（如??P-ATP摻入）相比，避免了放射性危害和廢料處理問題；與熒光法相比，無需激發光源，不受化合物自發熒光干擾。

二、試劑盒組分與規格

該試劑盒提供兩種規格：96孔板形式（100次反應）和384孔板形式（400次反應），每個試劑盒包含以下核心組分：

重組人CDK9/CyclinT激酶：純化的活性復合物，經質控驗證具有底物磷酸化活性。

激酶底物：適用于CDK9的底物，通常為含有特定絲氨酸/蘇氨酸殘基的合成肽段或全長蛋白。

ATP：高純度三磷酸腺苷，濃度經標定。

激酶檢測緩沖液：優化pH及離子成分，維持激酶最佳活性。

Kinase-Glo Max 發光試劑：即用型，避光保存。

詳細操作說明書：包含推薦反應體系、孵育時間及數據分析方法。

所有組分在收貨后按指示存儲（通常為-80°C），自收貨之日起6個月內保持最佳性能。Kinase-Glo試劑需避免反復凍融，建議分裝后于-20°C避光保存。

三、實驗流程簡要說明

以下為典型96孔板單次反應的操作步驟（總體積50 uL）：

1. 試劑準備

從-80°C取出CDK9/CyclinT激酶、底物、ATP及檢測緩沖液，置于冰上解凍。

平衡檢測緩沖液至室溫。Kinase-Glo試劑提前30分鐘取出平衡至室溫（避免反復加熱）。

準備待測抑制劑：用DMSO或緩沖液稀釋至所需濃度（建議設置10個濃度梯度，2倍或3倍倍比稀釋）。注意最終DMSO濃度不得超過1%（詳見禁忌說明）。

2. 激酶反應體系構建

每孔加入10 uL檢測緩沖液。

加入2 uL待測抑制劑或對照（DMSO/緩沖液/陽性對照如SNS032或LL-K9-3）。

加入5 uL CDK9/CyclinT激酶（推薦起始濃度0.5–10 nM，需預實驗優化至消耗30–50% ATP）。

加入10 uL激酶底物（終濃度依說明書推薦，通常為0.1–1 ug/孔）。

加入3 uL ATP（終濃度通常為10–100 uM，接近或低于K?值以獲得最佳抑制靈敏度）。

用檢測緩沖液補足總體積至25 uL（具體體積以說明書為準）。啟動反應。

3. 激酶反應孵育

用封板膜覆蓋，室溫或30°C孵育30–60分鐘（使ATP消耗處于線性區間）。

4. 發光檢測

加入25 uL Kinase-Glo Max試劑（與反應體系等體積）。

在搖床上混合1–2分鐘，室溫孵育10–30分鐘（使發光信號穩定）。

使用發光酶標儀（讀板模式：終點法，積分時間0.5–1秒）讀取發光值（RLU）。

5. 數據分析

Dinaciclib抑制CDK9/CyclinT激酶活性。

四、應用場景

本試劑盒主要面向以下兩大類核心應用：

1. 小分子激酶抑制劑的篩選與IC50測定

2. 酶動力學研究

五、性能特點與注意事項

線性范圍與Z'因子：在優化條件下（激酶消耗30–50% ATP），Z'因子通常大于0.7，滿足高通量篩選對統計學可靠性的要求。信號窗口（信背比）通常>5倍。

DMSO耐受性：體系中DMSO終濃度不得超過1%（見Contraindications），否則會抑制激酶活性或干擾熒光素酶反應。建議將化合物母液濃度配制成至少100×，加入反應體系后稀釋至1%以下。

ATP濃度選擇：為篩選ATP競爭性抑制劑，建議使用接近或低于K?的ATP濃度（如10 uM）；為評估非競爭性抑制劑或進行選擇性譜分析，可使用飽和ATP濃度（如1 mM）。用戶需根據研究目的調整。

反應時間優化：首次使用應進行時間進程實驗，確保激酶反應在線性區間內（通常30–60分鐘）。過度反應導致ATP耗盡，將無法區分抑制程度的差異。

陽性對照：建議使用已知CDK9抑制劑如SNS032、 flavopiridol或降解劑LL-K9-3作為陽性對照，驗證體系性能。

化合物干擾排除：某些化合物可能抑制熒光素酶活性（“火螢光素酶抑制劑”）或淬滅發光信號。建議設置“化合物+Kinase-Glo（無激酶反應體系）”對照，評估化合物對檢測試劑的直接影響。若存在干擾，需使用替代檢測方法（如放射性濾膜結合法）進行交叉驗證。

六、文獻參考

Napolitano G, et al., 2003 J Cell Physiol. 197(1):1-7.

Li J., et al., 2022 J Med Chem. 65(16):11034-11057.