文獻解讀-TopoGEN-貓眼草黃素作為潛在抗癌藥物對拓撲異構酶I和II的抑制性評估

拓撲異構酶（topoisomerase）是一類在DNA復制、重組、轉錄和修復過程中起關鍵作用的酶。根據催化功能和氨基酸序列，人的拓撲異構酶主要分為兩類：拓撲異構酶I（Topoisomerase I）和拓撲異構酶II（Topoisomerase II）。拓撲異構酶I通過切割DNA單鏈發揮作用，而拓撲異構酶II則切割DNA雙鏈。這兩種酶在癌癥治療中具有重要意義，因為它們在某些癌細胞中高表達，因此成為抗癌藥物的重要靶點。然而，現有的拓撲異構酶抑制劑（如道諾霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、依托泊苷、伊立替康和拓撲替康）雖然在臨床上用于治療癌癥，但副作用嚴重，如心臟毒性、免疫系統抑制、震顫和發熱等。因此，尋找毒性更小的新型拓撲異構酶抑制劑具有重要意義。

貓眼草黃素（Chrysosplenetin）是一種甲氧基黃酮類化合物，廣泛存在于某些菊科植物中，如德國洋甘菊（Chamomilla recutita）和青蒿（Artemisia annua）。它具有多種生物活性，包括抗骨質疏松、抗酪氨酸酶和抗神經氨酸酶活性，以及抗菌和抗癌作用。特別是，它對乳腺癌細胞系（如MCF-7、MDA-MB-231和T47D）具有選擇性抑制作用，而對正常非腫瘤細胞（如MRC-5和HUVEC）的毒性較小。”In vitro and in silico assessment of DNA interaction, topoisomerase I and II inhibition properties of （Chrysosplenetin）” 主要研究了天然黃酮類化合物貓眼草黃素與DNA的相互作用及其對拓撲異構酶I和II的抑制作用。

貓眼草黃素與拓撲異構酶I和拓撲異構酶II共價DNA復合物的結合（A、B）和相互作用（C、D）模式。貓眼草黃素以棒狀圖表示，拓撲異構酶的主鏈以帶狀圖表示，DNA分子則根據原子的靜電勢以分子表面渲染，顏色漸變從紅色到白色再到藍色，其中紅色代表最低的勢能，藍色代表最高的勢能。

實驗方法

材料與試劑：實驗中使用了貓眼草黃素（從青蒿中提取，純度>95%）、pBR322超螺旋質粒DNA、人拓撲異構酶I和II（均購自Topogen）、細胞培養基、MTS細胞增殖檢測試劑盒等試劑。

細胞毒性實驗：通過MTS法評估貓眼草黃素對MCF-7乳腺癌細胞系的細胞毒性。將細胞接種于96孔板中，加入不同濃度的貓眼草黃素孵育72小時后，測定細胞增殖情況。

DNA水解切割實驗：使用瓊脂糖凝膠電泳評估貓眼草黃素對pBR322超螺旋質粒DNA的水解切割作用。將DNA與不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態的變化。

DNA保護實驗：通過Fenton反應產生羥基自由基，評估貓眼草黃素對pBR322超螺旋質粒DNA的氧化損傷保護作用。將DNA與Fenton試劑及不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態的變化。

拓撲異構酶抑制實驗：使用瓊脂糖凝膠電泳評估貓眼草黃素對拓撲異構酶I和II的抑制作用。將超螺旋pBR322質粒DNA與拓撲異構酶及不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態的變化。

分子對接研究：使用AutoDockTools和MacroModel軟件進行分子對接研究，評估貓眼草黃素與DNA及拓撲異構酶I和II的結合模式和親和力。

實驗結果

細胞毒性：貓眼草黃素對MCF-7細胞具有顯著的細胞毒性，IC50值為0.29μM。這與先前的研究結果一致，表明貓眼草黃素對乳腺癌細胞具有顯著的抑制作用。

DNA水解切割：在不同濃度的貓眼草黃素作用下，pBR322超螺旋質粒DNA的形態未發生變化，表明貓眼草黃素未引起DNA的水解切割。

DNA保護：貓眼草黃素以濃度依賴的方式顯著保護了pBR322超螺旋質粒DNA免受Fenton反應產生的羥基自由基的損傷。這表明貓眼草黃素具有抗氧化和DNA保護作用。

拓撲異構酶抑制：貓眼草黃素對拓撲異構酶I和II均表現出顯著的抑制作用。特別是在12.5-100μM濃度范圍內，對拓撲異構酶II的抑制率達到了83-96%。這表明貓眼草黃素可能通過抑制拓撲異構酶的活性來發揮其抗癌作用。

分子對接研究：分子對接研究表明，貓眼草黃素能夠通過插入或溝槽結合的方式與DNA結合，并通過與拓撲異構酶I和II的活性位點結合來抑制其活性。這些結果進一步支持了貓眼草黃素作為潛在抗癌藥物的潛力。

貓眼草黃素對拓撲異構酶I的抑制作用。1:DNA對照；2: DNA + 1u拓撲異構酶；3-6:DNA + 1u拓撲異構酶I +黃銅礦素（12.5, 25, 50, 100 μm）。	貓眼草黃素對拓撲異構酶II的抑制作用。1:DNA對照；2: DNA + 1u拓撲異構酶；3-6:DNA + 1u拓撲異構酶II +黃銅礦素（12.5, 25, 50, 100 μm）。

Topogen品牌的人拓撲異構酶I和II在藥物研發領域具有廣泛的應用價值。它們不僅可用于篩選和評估新型抗癌藥物的拓撲異構酶抑制活性，還可用于研究拓撲異構酶的結構與功能關系，以及探索新型抗癌藥物的作用機制。此外，這些酶還可用于建立高效的藥物篩選平臺，加速抗癌藥物的研發進程。