TopoGEN松弛的pHOT-1質粒DNA底物，測定DNA旋轉酶超螺旋活性

松弛pHOT-1是一種適用于測定DNA旋轉酶超螺旋活性的DNA質粒。它也可用于測定DNA連接數的變化，以評估插層。使用高純度topo I弛豫反應制備質粒，然后對弛豫產物進行滅活和再純化。TopoGEN隨后驗證每批的松弛狀態，并驗證底物可以被大腸桿菌DNA旋轉酶和金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶超螺旋化。

這種質粒非常適合檢測任何拓撲異構酶。pHOT-1相對較小（<3KB），非常適合展示中間態拓撲異構體。由于所有拓撲異構酶都表現出簡并的DNA結合和切割序列，pHOT-1將有效地支持廣泛的拓撲異構酶活性。超螺旋pHOT-1是pBR322的縮小衍生物，優化以獲得更高的產量。對于希望評估人類拓撲異構酶I在單一序列上的切割的研究者，它還有一個額外的特性：我們包含了人類拓撲異構酶I的首選結合位點（由Westergaard及其同事描述的十六核苷酸序列，見Bonven等人，1985年），該序列源自四膜蟲核糖體基因重復序列。這個構建作為拓撲異構酶I切割底物非常有用，因為在沒有喜樹堿的情況下，酶在十六核苷酸位點有效切割。這允許研究者嚴格評估新的潛在拓撲異構酶I抑制劑，因為單一背景切割是內置的對照；如果該劑刺激在包含十六核苷酸位點的片段的這個和/或任何其他序列的切割，明顯的切割很容易被揭示出來。通常，很難在DNA上捕獲拓撲異構酶I切割；必須使用更多的酶，因為切割復合物會消耗酶的化學計量。由于這個原因，分析DNA切割需要更高水平的酶。該片段可以從多克隆位點使用下面顯示的位點分離出來（Maniatis克隆書中的協議），末端標記并用作切割底物。

艾美捷TopoGEN松弛的pHOT-1質粒DNA底物：

編號：TG2035

分類：DNA底物

標簽：dna底物，pHOT1，松弛DNA底物，松弛pHOT1

存儲緩沖液：所有DNA都存儲在TE緩沖液（10 mM Tris-Cl（pH 7.5），1 MM EDTA）中，濃度如上右上角指定。

存儲和運輸條件：這些DNA應存儲在4°C下。DNA在常溫下運輸（或可能與酶運輸一起在干冰上運輸）。

質量控制分析：

?使用A260/A280比率法光譜測定純度。在最適Gyrase活性條件下孵育，未導致任何可檢測的DNA轉化為缺口或線性DNA形式。

?對于超螺旋和松弛的DNA底物，超過85%的DNA將呈超螺旋（形式I）DNA，其余為缺口開放環狀（形式II）DNA。沒有可檢測的線性DNA形式。

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