TopoGEN金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶質量控制測試方案

DNA旋轉酶是由金黃色葡萄球菌中的兩個基因GyrA和GyrB編碼的II型拓撲異構酶。DNA旋轉酶是一種基本的拓撲異構酶，通過鏈斷裂/重新連接和DNA纏繞的過程使DNA超螺旋化。作為一種II型酶，旋轉酶在使松弛的質粒DNA底物負超螺旋化方面具有獨特性。DNA旋轉酶也是喹諾酮類抗菌劑的靶標，這些抗菌劑通過使酶轉變為DNA損傷劑來發揮作用。TopoGEN提供來自革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌的純化DNA旋轉酶，用于藥物開發和篩選測定的各個方面。該酶在解鏈和超螺旋化動力DNA（kDNA）方面非?；钴S，但也會使松弛的質粒DNA負超螺旋化。金黃色葡萄球菌酶是一個GyrA2GyrB2的異源四聚體，作為帶有His標簽的亞基純化，重新組裝成活性酶。

儲存和運輸條件：

該酶應儲存在-20°C，并在這種濃縮狀態下至少穩定6個月。酶可以在首次解凍時分裝，以最小化多次凍融循環造成的損害。

單位定義：

一個單位將在37°C下，在以下描述的條件下，在30分鐘內使100 ng的質粒超螺旋化。DNA旋轉酶也會像所有II型酶一樣解鏈kDNA；然而，產物將是負超螺旋化的微型kDNA。

艾美捷TopoGEN金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶（TG2000GSA）質量控制測試：

1. DNA旋轉酶亞基通過公司專有方法克隆、過表達并純化。通過CB染色在SDS-PAGE上為每個亞基檢測到單一帶。通過在優化I型活性的條件下測試超螺旋DNA的松弛來評估拓撲異構酶I的交叉污染。在這些條件下，與超螺旋質粒DNA孵育2小時后，未檢測到松弛產物。

2. 通過測試線性kDNA和線性質粒DNA的形成來進行核酸酶污染測試。在10 mM MgCl2存在下，對1 ?g的連環kDNA或超螺旋DNA進行孵育（37°C下4小時）。在這些條件下，未產生線性DNA或分解產物。

3. 根據SDS-PAGE，亞基純度超過95%。沒有另一個亞基的情況下，任一亞基都不活躍，且任一亞基都不顯示核酸酶活性。這些數據表明，宿主（大腸桿菌）不對金黃色葡萄球菌gyrA或B的單個亞基的活性有所貢獻。這一點通過使用特異性針對大腸桿菌的抗GyrA IgG的Western blotting探針得到了證實（數據未顯示）。

測定條件：

TopoGEN提供用于測定金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶的三種緩沖液樣品。緩沖液如下：

5X測定液（提供0.5 ml）包含以下溶質：

375 mM Tris-HCl（pH 7.5）

37.5 mM MgCl2

37.5 mM DTT

0.375 mg/ml BSA

150 mM KCl

10X ATP液：20 mM ATP（0.25 mL）。酶需要最終濃度為2.0 mM ATP。

5X鉀谷氨酸液：2.5M（0.25 mL）。酶需要最終濃度為500 mM K-Glu。

*注：這些緩沖液提供給客戶，以便為旋轉酶測定建立工作對照。可能需要額外的緩沖液，建議客戶按照上述配方進行補充。

所有緩沖液應儲存在-20°C。

TopoGEN金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶文獻參考：

1. Kato et al. (1990) Cell 63:393-404.

2. Peng, H., and Marians, K. (1999). DNA Topoisomerase Protocols Volume I; page 163

3. Wang, J. (1996) DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem 65:635-692

4. Levine et al., (1998) Biochem Biophys Acta 1400:29-43

5. Strahilevitz, J and Hooper, D. (2005) 49:1946-1956

艾美捷科技是TopoGEN的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。