96孔板ROCK活性檢測試劑盒，檢測ROCK對MYPT1在Thr696位點的特異性磷酸化

Rho家族成員是信號通路中的關鍵調控組分，通過重排肌動蛋白細胞骨架來指導細胞運動、黏附和細胞分裂。Rho通過細胞外信號（如溶血磷脂酸，LPA）激活。Rho的作用通過下游Rho效應分子介導，其中一種效應分子是Rho相關激酶（ROCK）。目前已鑒定出兩種ROCK亞型：ROCK-I（也稱為ROKβ）和ROCK-II（也稱為Rho激酶和ROKα）。ROCK通過磷酸化多個底物介導Rho信號傳導，并重排肌動蛋白細胞骨架，這些底物有助于肌動蛋白絲的組裝和收縮性。例如，ROCK通過特異性磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶標亞基1（MYPT1）的Thr696位點使肌球蛋白磷酸酶失活，從而導致20 kDa肌球蛋白輕鏈（MLC20）的磷酸化含量增加。

Cell Biolabs的96孔ROCK活性檢測試劑盒是一種酶免疫測定法，用于檢測ROCK對MYPT1在Thr696位點的特異性磷酸化。該試劑盒的微孔板預先涂覆了重組MYPT1。將底物孔與ROCK樣本（如純化的激酶、細胞或組織裂解液）孵育后，通過抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗體檢測磷酸化的MYPT1。

艾美捷96孔板ROCK活性檢測試劑盒（#STA-416）提供了一種非同位素、靈敏且特異的方法，用于通過其生理底物監測ROCK活性；它也可用于篩選ROCK抑制劑。試劑盒的檢測靈敏度下限為200 pg活性ROCK-II。試劑盒還提供了重組活性ROCK-II作為陽性對照。每套試劑盒提供足夠的試劑進行多達96次檢測。

相關產品：

1. STA-415：ROCK活性免疫印跡試劑盒

2. STA-400：Ras激活檢測試劑盒

3. STA-404：Rac/Cdc42激活檢測試劑盒組合

4. STA-405：Rho/Rac/Cdc42激活檢測試劑盒組合

5. STA-410：PAK1 PBD瓊脂糖珠

96孔板ROCK活性檢測試劑盒組成：

盒子1（室溫運輸）：

1. ROCK底物涂覆板（部件編號241601）：一個預先涂覆重組MYPT1的96孔板。

2. 10倍激酶緩沖液（部件編號241602）：一瓶20 mL，含250 mM Tris（pH 7.5）、100 mM MgCl?、50 mM甘油-2-磷酸、1 mM Na?VO?。

3. ATP溶液（部件編號241604）：一瓶100 ?L，含100 mM ATP。

4. 抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗體（部件編號241603）：一瓶20 ?L。

5. 二抗，辣根過氧化物酶偶聯物（部件編號231009）：一瓶20 ?L。

6. 檢測稀釋液（部件編號310804）：一瓶50 mL。

7. 10倍洗液（部件編號310806）：一瓶100 mL。

8. 底物溶液（部件編號310807）：一瓶12 mL，棕色瓶。

9. 終止液（部件編號310808）：一瓶12 mL。

盒子2（藍色冰袋運輸）：

1. 活性ROCK-II（部件編號241505）：一瓶20 ?L，含10 ng活性ROCK-II，溶于25 mM Tris（pH 7.5）、10 mM MgCl?、5 mM甘油-2-磷酸、0.1 mM Na?VO?、10%甘油、0.1% BSA。

未提供材料：

1. ROCK樣本（純化的激酶、細胞或組織裂解液）。

2. 裂解緩沖液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM甘油-2-磷酸、1% Triton X-100或1% Nonidet P-40、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na?VO?和蛋白酶抑制劑。

3. DTT。

4. 0.5 M EDTA。

5. 30°C恒溫箱或水浴。

6. 能在450 nm（620 nm作為可選參考波長）讀取的酶標儀。

儲存：

將活性ROCK-II儲存于-80°C，ATP溶液儲存于-20°C，其余試劑盒組分儲存于4°C。避免多次凍融循環。

結果示例：

以下圖表展示了使用Cell Biolabs的96孔ROCK活性檢測試劑盒獲得的典型結果。以下數據僅供參考。

圖1：ROCK-II活性檢測

左圖：活性ROCK-II在30°C下孵育60分鐘。

右圖：2.5 ng活性ROCK-II在30°C下按所示時間孵育。通過抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗體檢測MYPT1底物的磷酸化，具體方法見檢測協議。

圖2：ROCK-II活性免疫印跡檢測

將含有10 ng活性ROCK-II的1倍激酶緩沖液（25 ?L）與含有0.2 mM ATP和500 ng重組MYPT1的1倍激酶緩沖液（50 ?L）在30°C下孵育30分鐘。通過加入25 ?L 4倍SDS-PAGE樣品緩沖液終止激酶反應。泳道1、3、5、7：無激酶（陰性對照）；泳道2、4、6、8：有激酶。將200 ng（泳道1和2）、100 ng（泳道3和4）、50 ng（泳道5和6）或25 ng（泳道7和8）的重組MYPT1底物加載到SDS-PAGE上。通過抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗體檢測MYPT1底物的磷酸化，具體方法見產品編號STA-415的檢測協議。

96孔板ROCK活性檢測試劑盒文獻參考：

1. Etienne-Manneville, S., and Hall, A. (2002) Nature 420, 629-635.

2. Riento, K., and Ridley, A. J. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446-456.

3. Leung, T., Manser, E., Tan, L., and Lim, L. (1995) J. Biol. Chem. 270, 29051-29054.

4. Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chihara, K., Nakafuku, M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,

K., Iwamatsu, A., and Kaibuchi, K. (1996) EMBO J. 15, 2208-2216.

5. Totsukawa, G, et al., J. Cell Biol. (1999) 144, 735-744.