肌球蛋白S1片段(心臟),牛心臟的純化與使用

心肌肌球蛋白是從牛心組織中純化的（1, 2）。完整的肌球蛋白包括其必需輕鏈（ELC）和調節輕鏈（RLC）被純化，詳見圖1和圖2。隨后，肌球蛋白通過α-胰蛋白酶消化，釋放出可溶性的亞片段-1（S1）結構域，并通過離心分離（3）。純化的肌球蛋白S1片段已在F-肌動蛋白激活的ATP酶活性測定中被證實具有生物學活性（見生物學活性測定）。牛心肌肌球蛋白S1片段以白色凍干粉形式提供。

圖1. 肌球蛋白蛋白及其亞片段的示意圖

圖例：肌球蛋白是一種由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的六聚體蛋白。在鎂存在的情況下，肌球蛋白可以通過α-胰蛋白酶被蛋白酶解為重鏈肌球蛋白（HMM）和輕鏈肌球蛋白（LMM）。然而，在EDTA存在的情況下，α-胰蛋白酶會產生可溶性的肌球蛋白S1片段（3）。

圖2. 完整肌球蛋白和S1肌球蛋白

將20微克的完整牛心肌球蛋白（泳道A）和相應的S1肌球蛋白（泳道B）通過4-20% SDS-PAGE凝膠電泳分離，并用考馬斯亮藍染色。箭頭表示肌球蛋白重鏈（約200 kDa），箭頭表示調節輕鏈（約20 kDa）和兩種必需輕鏈同工型（約25 kDa和21 kDa）。蛋白定量采用Precision Red?蛋白測定試劑（貨號：ADV02）進行。Mark12分子量標記來自Invitrogen。

艾美捷肌球蛋白S1片段(心臟),牛心臟（#CS-MYS03）用途：

1. 測量鈣激活的肌球蛋白ATP酶活性，當其與細絲結合時。  

2. 識別/表征影響TT復合物調節和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白質或小分子。  

3. 識別/表征影響肌球蛋白/F-肌動蛋白相互作用的蛋白質或小分子。

儲存與復溶

短暫離心以使產品聚集在管底。用300微升Milli-Q水復溶1毫克的MYS03（10毫克瓶用3毫升）將產生濃度為3.3毫克/毫升的心肌S1肌球蛋白溶液，其緩沖液組成為：20 mM PIPES，pH 7.0，5%（質量/體積）蔗糖和1%（質量/體積）葡聚糖。該蛋白應避免反復凍融。凍干蛋白在4°C干燥條件下（濕度<10%）可穩定保存1年。

純度

通過掃描密度法對4-20%梯度聚丙烯酰胺凝膠上考馬斯亮藍染色的蛋白進行分析，確定用于產生肌球蛋白S1片段的肌球蛋白及其輕鏈的純度為90%（見圖2）。

生物學活性測定 ：

牛心肌球蛋白S1片段的生物學活性可通過其F-肌動蛋白激活的ATP水解速率來確定。測定方法是先將肌動蛋白聚合形成F-肌動蛋白，然后將心肌原肌球蛋白/原肌鈣蛋白復合物（TT復合物）與肌動蛋白絲按化學計量比混合。這會形成類似肌肉纖維細絲的包被絲。肌球蛋白以亞化學計量比加入，并用ATP和鈣啟動反應。嚴格的質量控制確保在缺乏鈣的情況下，TT復合物完全抑制肌球蛋白ATP酶活性。加入10微摩爾鈣后，肌球蛋白ATP酶活性將恢復。鈣與原肌鈣蛋白C結合，使其從F-肌動蛋白上解離，從而使肌球蛋白能夠結合。

試劑

1. 心肌TT復合物（1×1毫克，貨號：TT05）  

2. 心肌肌球蛋白S1（0.25毫克），貨號：MYS03）  

3. 心肌肌動蛋白（1毫克，貨號：AD99-A）  

4. ATP酶活性生化試劑盒（貨號：BK051）  

5. 100 mM ATP，溶于50 mM Tris-HCl，pH 7.5（100微升）  

6. 1 M二硫蘇糖醇，溶于水（100微升）  

7. PM12反應緩沖液（12 mM PIPES-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl?）  

8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0

肌球蛋白S1片段(心臟),牛心臟文獻參考：

1. Pollard, T.D., . 1982. Methods in Cell Biol. 24:333

2. Margossian, S.S., and Lowey, S. 1982. Methods in Enzymology.85:55-71.

3. Weeds, A.G., and Taylor, R.S. 1975. Nature (London) 257:54.

4. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.