SiR-肌動蛋白試劑盒--立即成像，無需洗滌步驟

SiR-actin 基于硅羅丹明（SiR）熒光團和肌動蛋白結合天然產物雅斯普霉素（jasplakinolide）。SiR-actin 可在活細胞中特異性地標記 F-肌動蛋白，背景低（1）。SiR-actin 的關鍵特性包括：i）遠紅光吸收和發射波長；ii）細胞通透性；iii）熒光生成特性；iv）與超分辨率顯微鏡技術（STED 和 SIM）兼容。這些特性在一個探針中的獨特組合使 SiR-actin 處于卓越的前沿。

艾美捷SiR-肌動蛋白試劑盒（#CY-SC001）物理性質：

- 吸收波長（abs）：652 nm  

- 發射波長（Em）：674 nm  

- 摩爾吸光系數（ε652 nm）：1.0×105 mol-1·cm-1  

- 分子量（MW）：1241.6 g/mol  

- 分子式（MF）：C71H88N8O10Si  

儲存與操作

收到后請將化合物保存在 -20°C 以下。使用無水 DMSO 配制化合物溶液。使用后請將溶液保存在 -20°C 以下。在打開小瓶之前，應讓其恢復至室溫。如果儲存得當，化合物應可在數月內保持穩定。注意：DMSO 溶液應特別小心處理，因為 DMSO 已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關當地法規處理這些試劑。

注意：本協議是使用貼附在蓋玻片上的人類成纖維細胞優化的，并已在其他常見細胞系中得到確認。實驗協議的建議應作為起點，每種細胞類型的最優標記條件應通過實驗確定。SiR-actin 基于肌動蛋白穩定藥物雅斯普霉素。因此，它可以改變活細胞中的肌動蛋白動態。盡管在高達 3 ?M 的 SiR-actin 濃度下，有絲分裂持續時間保持不變，但在培養的 HeLa 細胞中，超過 100 nM 的濃度會導致細胞增殖指數降低（1）。如果計劃進行長期成像實驗，且肌動蛋白動態至關重要，我們建議將 SiR-actin 的濃度保持在 100 nM 或以下。對于其他用途，建議使用 1 ?M 的 SiR-actin 進行染色。

配制 1 mM 儲備液

將 SiR-actin 小瓶中的內容物溶解在 50 ?L 無水 DMSO 中，制備 1 mM 儲備液。此溶液應保存在 -20°C 或以下。不要將溶液分裝成小份量，因為它們會更快降解，且該化合物不會因多次凍融循環而改變。如果儲存得當，此儲備液應可在三個月或更長時間內保持穩定。如果需要精確測定儲備液的濃度，將 1 ?L 1 mM 儲備液稀釋在含有 0.2% SDS 的 99 ?L PBS 中。在室溫下靜置 15 分鐘后，測量 652 nm 處的吸光度。使用上述摩爾吸光系數計算濃度。

配制染色液

將 SiR-actin 稀釋到所需的濃度，加入細胞培養基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暫渦旋。由于染色效率可能因細胞系而異，建議首次嘗試時使用 1 ?M 的濃度，以快速獲得強染色效果，然后在后續實驗中逐步降低 SiR-actin 的濃度，直至達到最佳染色效果（見下表中的標記濃度和孵育時間）。某些細胞系可能表達高水平的外排泵，導致 SiR-actin 染色效果不佳。在染色液中加入 10 ?M 的維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通常會顯著改善染色效果。僅使用新配制的染色液，不要重復使用。

細胞準備與染色

按照常規方法在蓋玻片、玻璃底培養皿或玻璃底多孔板上培養細胞。當細胞達到所需密度時，用染色液替換培養基，確保所有細胞都被溶液覆蓋。將細胞置于 37°C、含 5% CO? 的濕潤環境中孵育，并根據下表確定標記時間與探針濃度的關系：

細胞成像： 

SiR-actin 的成像最好使用標準的 Cy5 設置。標記后，活細胞可以立即成像，無需洗滌步驟?？蛇x地，用不含探針的新鮮培養基替換一次標記液，通?？梢蕴岣咝旁氡?。如果進行時間序列成像，建議在整個實驗過程中將探針濃度保持在 100 nM 或以下，以獲得穩定的信號并避免探針對肌動蛋白動態產生干擾（細胞增殖減少）。如果在成像前對細胞進行了洗滌，染色效果可維持數小時。

SiR-肌動蛋白試劑盒文獻參考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavi?ius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)