PCR系列

PCR，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。今天匯總PCR的知識點，例如終點PCR、定量PCR、反轉錄PCR等相關知識做基本介紹。

一、RNA定量

如何精準地檢測到病毒（定性）？如何有效判定出樣本中的病毒含量（定量）？借助分子生物學技術可以精準檢測病原體，其中的一步法RT-qPCR技術可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面。

一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉錄合成cDNA的過程與靶標基因的PCR擴增于一管內依次進行，利用熒光來監控PCR擴增產物的變化，進而判斷RNA初始量的技術即為一步法RT-qPCR技術。

RT-qPCR根據化學發光原理可以分為兩大類：

一類為染料類，包括SYBR@Green I，通過熒光染料來指示產物的增加；

一類為探針類，包括TaqMan@探針，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。

二、miRNA的定量方法

常用的對miRNA的定量方法主要有兩種，分別為莖環引物法、加尾法。提供基于加尾法的All-in-One miRNA qRT-PCR 系列試劑盒和驗證引物，用于miRNA表達量的高效檢測。

三、高GC含量PCR

在DNA（A、T、C、G）4種堿基中，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率稱為GC含量。因為G、C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，所以模板很難打開，高GC含量（G+C≥60%）模板擴增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩定的二級結構妨礙DNA聚合酶在模板上的推進，而且模板上可能存在多個非特異性的引物復性位點，導致非特異性擴增，甚至很多時候擴增不出靶基因。

您還在為高GC含量PCR煩惱嗎？您還在為擴增不出來結果而焦心嗎？PCR試劑領軍品牌Solis BioDyne可以為您輕松解決這個難題，可同時提供適合高GC含量PCR的預混液以及添加劑：

四、PCR疑難問題

1、終點PCR

終點PCR，顧名思義既是對PCR擴增反應的終產物進行定性及定量分析，在反應過程中無法監測反應進行情況，只有反應完成后通過跑膠得到結果。

2、熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標記的探針對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，并結合相應的軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

3、逆轉錄PCR

逆轉錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉錄成為互補 DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。在實際應用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個反轉錄實驗過程有三個重要的因素，分別是RNA模板、反轉錄時所使用的引物類型、反轉錄酶 。

五、轉長片段PCR

傳統的PCR通常只能擴增3kb以內的短片段，對于3kb以上的長片段很難進行有效擴增。

艾美捷提供相對長片段PCR的兩種DNA聚合酶（FIREPol? Blend Master Mix）進行反應：一種是常規PCR反應中應用的耐熱FIREPol? DNA聚合酶，它具有很強的延伸能力，依賴此酶進行鏈的延伸；另一種是具有3’→5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，它具有較好的校讀功能，可以將錯配的堿基切割下來重新利用第一種酶進行鏈的延伸。兩種酶各有優缺點，充分利用第一種酶的延伸能力和第二種酶的校讀功能，使兩種酶在反應中相輔相成，完成長片段DNA的擴增。