一步法RT-qPCR試劑盒，讓你的PCR一步到位

      隨著新冠病毒肆虐全球，聊病毒是個敏感話題。今天我們就從這個敏感話題著手，好好聊一聊。

       病毒是一種個體微小，結構簡單，只含一種核酸（DNA或RNA）。我們現在提起來就咬牙切齒的的新冠病毒（COVID-19），就是一種RNA病毒。當然除了COVID-19，我們常聽到的其他臭名昭著之輩，如艾滋病病毒、流感病毒、登革熱病毒、煙草花葉病毒、噬菌體等均屬于RNA病毒。這些RNA病毒讓之所以讓我們談虎色變，是因為很多RNA病毒具有非常強的侵略能力，會嚴重影響宿主生命活動。如何精準地檢測到病毒（定性）？如何有效判定出樣本中的病毒含量（定量）？借助分子生物學技術可以精準檢測病原體，其中的一步法RT-qPCR技術可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面，廣泛用于食品安全、動物疫病、疾病診斷與治療效果評估等臨床與公共衛生等領域。

      一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉錄合成cDNA的過程與靶標基因的PCR擴增于一管內依次進行，利用熒光來監控PCR擴增產物的變化，進而判斷RNA初始量的技術即為一步法RT-qPCR技術。RT-qPCR根據化學發光原理可以分為兩大類：一類為染料類，包括SYBR^@Green I，通過熒光染料來指示產物的增加；一類為探針類，包括TaqMan^@探針，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。

       染料法：

      常用的SYBR^@Green I是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。SYBR^@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR^@Green 熒光染料，SYBR^@Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR^@Green染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

      作為全球最大的克隆供應商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ One-Step SYBR® Green RT-qPCR kit是基于SYBR Green 染料法的Real Time One-Step RT-PCR反應試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉錄反應和定量檢測可在同一反應管內完成，簡化操作的同時可有效降低污染的風險。試劑盒包含了性能優異的逆轉錄酶，以及含有熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預混液。在逆轉錄酶作用下RNA逆轉錄成cDNA，并使用抗體修飾的Taq DNA聚合酶進行Real Time PCR反應，抗體的完全封閉有效避免了聚合酶在熱循環反應前被激活。另外，經優化的Buffer體系大大提高了PCR反應的擴增效率和特異性，且檢測靈敏度可達0.1pg總RNA，適用于各類型RNA模板的檢測。

       一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒優勢：

      靈敏度高：可從低至0.1pg的RNA提取物中精確檢測目標RNA。

      特異性強：有效抑制引物二聚體及非特異性擴增的產生。

      擴增效率高：在寬廣的GC含量范圍內能維持高擴增效率。

       一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒：

      圖3. 使用一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒，對HeLa細胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，并設無模板對照（NTC組）。 A.GAPDH的擴增曲線（紅色）； B.Actin的擴增曲線（藍色）； C.GAPDH（紅色）和Actin（藍色）擴增片段的熔解曲線。

      圖2. 一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒（紅色）與Competitor T試劑盒（藍色）產品的性能比較。對HeLa細胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg。 A.HeLa細胞提取物中GAPDH擴增曲線的比較； B.HeLa細胞提取物中Actin擴增曲線的比較。

       探針法：

      PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。再通過實時監測整個PCR進程熒光信號的積累，與標準曲線對比進行定量分析。

      作為全球最大的克隆供應商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit是基于探針法的Real Time One-Step RT-PCR反應試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉錄反應和定量檢測可在同一反應管內完成，簡化操作的同時可有效降低污染的風險。試劑盒包含了性能優異的逆轉錄酶，以及含有熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預混液。在逆轉錄酶作用下RNA逆轉錄成cDNA，并使用熱啟動Taq DNA聚合酶進行cDNA擴增，在DNA擴增期間，與DNA上的靶點結合的靶特異性探針被Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，報告基團釋放并發出熒光。

      一步法RT-qPCR探針法定量試劑盒：

       圖1. 一步法RT-qPCR探針法定量試劑盒（紅色）與Competitor P試劑盒（藍色）產品的性能比較。使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對HeLa細胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成6個樣本，總量的范圍為10 ng至0.1 pg。

      圖2. 使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對HeLa細胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進行單通道和三通道分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，結果顯示，單通道和三通道的擴增效率相同。

      艾美捷科技有限公司，通過提供完整的產品和服務體系、便利的客戶關系和供應鏈管理，為生命科學研究工作者提供整體打包方案。我們的企業的核心價值觀：“激情、敬業、學習、創新、合作、卓越”。作為一家具有尖端的技術實力、一流的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業，總部位于武漢光谷國家級高新技術開發區，服務面向全國。艾美捷科技是集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，為用戶提供最前沿的專業資訊、完備的產品、整合的解決方案，及優質的物流服務。為了更好的服務客戶，公司組建了一支經驗豐富的研發團隊-艾美捷生物技術中心，進入研發生產階段，將更優質的產品推薦給國內生物領域的同仁們!

      艾美捷科技與國內外優秀的生物試劑供應商保持著密切的合作關系，目前已成為眾多國際知名品牌的中國總代理或一級代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne、CytoNiche、Matreya LLC等，可以在第一時間為用戶提供最前沿的專業資訊、完備的產品及物流服務。

                       三點：

                   企業使命：激發我們內在的創造力，提供有競爭力的生物醫學產品和服務，持續為客戶創造最大價值。

                   企業愿景：成為受人尊重、世界一流的生物醫學產品及服務供應商。

                      艾美捷定位：通過提供完整的產品和服務體系、便利的客戶關系和供應鏈，為生命科學研究工作者提供整體打包方案。

                   六觀：

                   價值觀：激情、敬業、學習、創新、合作、卓越。