提高PCR擴增特異性，BlazeTaq; SYBR; PCR試劑盒了解一下

      疫情當下，最熱頻的詞匯莫過于核酸檢測了。而核酸檢測最核心的技術也越來越被大眾所熟知，就是我們高中就學過的聚合酶鏈式反應，又稱為PCR。

      自從1983年，Kary Mullis才發明出這個用于擴增目標DNA的研究工具—PCR技術后，其逐漸成為分子生物學研究必不可少的一部分，被廣泛應用于基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。而Kary Mullis也因這一發明獲得了1993年的諾貝爾化學獎。

      而熟悉PCR的同學們都知道，PCR之所以能夠在短時間內將單個DNA分子擴增數百萬倍以便于下游實驗檢測，主要依靠這三個步驟連續多次循環而實現：

    （1） DNA變性：首先對雙鏈DNA模板進行高溫加熱，使DNA雙鏈變性解離成單鏈；

    （2） 引物退火：被稱為引物的短DNA分子與目標DNA的側翼區域結合；

    （3） 延伸擴增：DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進行延伸。將這些步驟重復（“循環”）25-35次，即可按指數方式獲得精確的目標DNA拷貝。

      而PCR這項核心技術的核心是強大的DNA聚合酶，其在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色，是PCR反應不可或缺的組成部分，是保證PCR擴增產物特異性、熱穩定性、保真度等方便的重要因素。

      而對目的基因進行PCR擴增的過程中，延伸錯配的非特異產物和引物二聚體的產生是PCR實驗中常遇到的問題，這些都與DNA聚合酶有關。因為這種非特異擴增會顯著降低目的基因擴增的產率和靈敏度，從而影響擴增結果的合理解釋和下游實驗應用的成功。

       那么，問題來了，如何減少非特異性擴增？

      方案之一：在冰上配制PCR反應，這是我們經常的操作。因為這樣有助于將DNA聚合酶的活性保持在低水平。

      但在PCR開始之前，依然可能會合成不需要的產物。

       另一個辦法是將DNA聚合酶的加入時間推遲到第一個循環的退火步驟。因為只有在90℃以上的初始變性步驟之后才能開始擴增，所以該技術被稱為“熱啟動”。所以后來為了避免非特異性擴增，科學家們開始進行手動熱啟動PCR反應，但是這個過程不僅費時費力，而且會增加樣品污染和降低實驗可重復性的風險。

      后來，人們發明了具有熱啟動特性的DNA聚合酶，既抗體修飾的DNA聚合酶。

      這種DNA聚合酶通過對酶活性位點抗體修飾，抑制其在室溫下的活性，在初始高溫變性步驟（如，>90℃）階段，結合的抗體失活，從而激活DNA聚合酶。

      由于DNA聚合酶在室溫下的活性被抑制，所以，熱啟動技術為在室溫下配制多個PCR反應體系提供了極大的便利，且不會影響特異性和擴增能力

      而BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列PCR試劑盒既是基于抗體修飾法的qPCR定量檢測試劑盒。

      BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0系列試劑盒采用了新型抗體修飾的BlazeTaq™熱啟動DNA聚合酶，室溫時酶的活性被抗體完全封閉，更有效地抑制非特異性擴增；反應時只需95°C預變性30 s即可使酶完全被激活，可明顯地縮短qPCR反應時間。此外，優化的Buffer體系顯著提高Real Time PCR反應的靈敏度和重復性，同時具有擴增效率高、特異性強、檢測范圍廣的特點，并能有效抑制引物二聚體的產生，使實驗結果更加可靠。

      本產品提供了一種通用的反應條件及實驗操作流程，且推出帶有、或不帶有ROX參比染料的兩個版本供用戶選擇，適用于大多數熒光定量 PCR 儀。

       產品優勢

      靈敏度高：可檢測低至5個拷貝數的DNA模板

      特異性強：抗體修飾熱啟動DNA聚合酶，更有效抑制引物二聚體以及非特異性擴增的產生

      擴增效率高：在寬廣的GC含量范圍內能維持高擴增效率

      操作簡單：預先配好的5×預混液，反應前只需加入模板、引物、滅菌水

      適用性廣：提供帶有或不帶有ROX的兩個版本可選，適用于大多數熒光定量PCR儀

      圖1. 使用BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0擴增8個10倍梯度稀釋的雙鏈DNA片段，DNA拷貝數范圍為5×10⁷~5個拷貝。如圖所示，試劑盒顯示出高靈敏度的特性，在寬廣的定量范圍內具有優異的線性相關性。

        競品產品性能對比：

      圖2.使用Hela細胞系的梯度稀釋的cDNA擴增B2M基因。BlazeTaq™（紅色）與BioRad SsoAdvanced™ Universal SYBR^® Green Supermix（藍色）的性能對比顯示在相似擴增性能下，前者具有更強的信號。

       圖3. BlazeTaq™（紅色）與Powerup™ SYBR Green Master Mix（綠色）和Promega（藍色）GoTaq^® QPCR Master Mix（綠色）的性能對比顯示，其靈敏度、擴增效率和特異性更高。

      圖4. Ct值比較。 使用BlazeTaq™（藍色），Applied Biosystems的PowerUp™ SYBR Green Master Mix（橙色）和來自Promega的GoTaq^® qPCR Master Mix（灰色）擴增來自10 ng HeLa cDNA的41個基因。

      圖5.使用BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0分別擴增50個和5個拷貝數的同一個DNA模板，并設無模板對照（NTC組），每組qPCR反應重復24次。結果顯示，試劑盒對低濃度模板的擴增實驗重復性好。cDNA的41個基因。

      圖6. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分別擴增不同GC含量（GC含量范圍在39.3~61.2%之間）的DNA模板。結果顯示，各模板的擴增效率仍能維持在90%~110%之間，表明試劑盒對GC含量在一定范圍內的DNA模板適用性廣。

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