PCR疑難問題粉碎機（三）——逆轉錄PCR

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機（一）——終點PCR

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機（二）——熒光定量PCR

       逆轉錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉錄成為互補 DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。在實際應用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個反轉錄實驗過程有三個重要的因素，分別是RNA模板、反轉錄時所使用的引物類型、反轉錄酶 。

       RNA模板

      高質量的 RNA 基本有幾個參數可供參考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值應該都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，說明 RNA 中有一些蛋白質的殘留，如果這個值大于 2.1，則很可能樣本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，說明 RNA 中含有異硫氰酸胍，酚殘留，而這些物質對逆轉錄反應影響是非常大的。另外就是瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈現三條帶，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈現遞增狀態，依據物種不同可逆轉錄 PCR能存在些許差異。當 RNA 出現降解時，反饋最明顯的是 5s rRNA 的亮度顯著提高。下圖展示的分別是高質量 RNA、稍有降解以及完全降解的實例：

       反轉錄引物

      提取到了高質量的 RNA模板后，下一個需要考慮的問題便是引物的選擇了。通常，反轉錄引物有三類，分別是 oligodT、隨機引物和序列特異性引物：oligodT引物能特異性結合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反轉錄反應，但這一特性決定了它只能擴增含有 polyA 尾的 mRNA，而且對 RNA 模板的質量要求較高，一旦 polyA 尾發生降解，就不能被引物所識別，從而導致產物中沒有相應基因的cDNA；隨機引物一般含有 6-9 個隨機序列的堿基，能夠隨機識別結合在 RNA 模板上，因此這類引物的優點在于能同所有類型的 RNA 結合，而且比較適合于含有二級結構的 RNA 及微量樣本，具有較高的反轉錄靈敏度。

      但缺點在于，結合的隨機性會造成 cDNA小片段較多，有時候還會對微量目的片段造成稀釋；序列特異性引物，顧名思義，針對于特定的序列設計的反轉錄引物，用于特異性的反轉錄某一段序列。在實際的應用中，我們通常會研究同一個個體或細胞中不同基因表達水平的變化，因此序列特異性基因相對用的少一些。Solis BioDyn 可供的反轉錄預混液中可提供多種不同的引物（oligodT、隨機引物、以及 oligodT 與隨機引物的結合）供您選擇，滿足您的一切實驗需求！

       逆轉錄酶

      Solis BioDyn 可提供兩種逆轉錄酶：分別是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆轉錄酶。RNase H，是一種核糖核酸內切酶，可以特異性地水解DNA-RNA 雜合鏈中的 RNA，不能水解單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA。

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