新型雙泛素底物—精準檢測去泛素化酶活性

     【前情回顧】LifeSensors超全泛素及多聚泛素鏈

      泛素-蛋白酶體（ubiquitin-proteasome system，UPS）途徑介導的蛋白降解是機體調節細胞內蛋白水平與功能的一個重要機制。負責執行這個調控過程的組成成分包括泛素及其啟動酶系統和蛋白酶體系統。泛素啟動酶系統負責活化泛素，并將其結合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素鏈，即泛素化。蛋白酶體系統可以識別已泛素化的蛋白并將其降解。此外，細胞內還有另一類形成反向調節的解離泛素鏈分子的蛋白酶——去泛素化酶(Deubiquitinase，DUB)。

      在UPS系統中，DUBs主要通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵,將泛素分子特異性的從鏈接有泛素的蛋白質或者前體蛋白上水解下來。DUBs對蛋白質的結構和泛素化的方式（如K48、K63、K11等）都具有選擇性，因此不同的DUBs在調節泛素化修飾中起到了各種各樣的作用。不斷有研究發現許多DUBs的功能紊亂與多種疾病相關，包括癌癥、神經退行性疾病、血液疾病、以及一些傳染病。并且，DUBs目前也已經成為重要的藥物作用靶點。DUBs活性檢測的難點是合成一種適用于高通量篩選（high-throughput screening，HTS）的生理學相關底物以反映DUBs的異肽酶活性。

       當前，用于測量泛素/泛素樣蛋白（Ub/Ubl）異肽酶活性的可商購試劑和檢測方法是主要基于對線性肽-或酰胺鍵的裂解，但是這種裂解方式無法反映真實的異肽鍵的幾何類型。另外，用于實時監測多聚泛素鏈降解的其他基于熒光的均相測定法需要多個酶促步驟，或者需要在泛素分子的N末端進行特異性修飾，這些處理都會破壞蛋白構象的完整性。目前的這些檢測試劑和測定方法無疑還無法滿足研究學者對DUBs活性檢測在均一穩定性，生物學相關和高通量篩選分析上的需求。

      作為泛素研究領域的專家，LifeSensors可為您提供一種新型的雙泛素底物，通過反應后的熒光讀數反應DUBs活性。LifeSensors提供的雙泛素分子（Diubiquitin，DiUb）是K48或K63（最廣泛形式的多泛素連接）通過異肽鍵連接的形式。這些底物可用于確定DUBs對底物的特異性，監測DUBs介導的異肽裂解的動力學參數，以及研究多泛素化蛋白的選擇性去偶聯。

       這些雙泛素底物是一類新的連續性試驗底物，用于研究異肽鍵的裂解。野生型泛素C末端一般是通過異肽鍵與第二個泛素分子的Lys48或Lys63連接，其中一個泛素分子上標記了熒光猝滅劑，另一個泛素分子上標記了熒光報告基團，這樣就形成了一個內部猝滅的能量轉移熒光分子對（IQF-diubiquitins）。雙泛素分子未裂解時，報告基團的熒光信號被猝滅基團吸收，檢測不到熒光信號，加入DUBs后，雙泛素分子底物被裂解，導致猝滅熒光基團與報告熒光基團分離，熒光信號增強。每個雙泛素底物都可以在不同位點（K63-1-2-3-4-5-6或K48-1-2-3-4-5-6）進行標記，以便對特定的DUBs形成優化的雙泛素底物。重要的是，熒光和淬滅基團的引入并不影響泛素分子的天然結構。通過這種生理底物檢測泛素異肽酶活性的方法是對真核蛋白質組學這一重要研究領域的重大突破。

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