mRNA內部m7G修飾的首個識別蛋白QKI (Quaking)

m6A修飾是mRNA上豐度最高的內部修飾，RNA修飾的通過特定的識別蛋白：YTHDF蛋白家族、YTHDC蛋白家族、IGF2BP蛋白家族等均可特異性識別mRNA上的m6A位點，從而調控mRNA代謝。mRNA上存在很多不同種類的化學修飾、比如m1G、m5G、m7G等。2019年，證實了m7G修飾存在于哺乳動物mRNA和miRNA的內部，并報道了METTL1-WDR4復合體作為相應的甲基化轉移酶。同時，中國科學院北京基因組研究所楊運桂教授開發了新的檢測技術，獲得了mRNA內部m7G修飾 的高分辨率圖譜。然而迄今為止，mRNA內部m7G修飾的特異性識別蛋白尚不清楚，這極大地阻礙了對mRNA內部m⁷G修飾功能的研究。因此，鑒定mRNA內部m7G修飾的特異性識別蛋白具有十分重要的意義。

2023.6.27，來自美國希望之城國家醫療中心陳建軍教授、蘇瑞助理教授及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的夏強教授合作，在Cell上發表標題題為 QKI shuttles internal m7G-modified transcripts into stress granules and modulates mRNA metabolism 的研究文章，篩選并鑒定出mRNA內部m7G修飾的首個識別蛋白QKI (Quaking)，而且報道了在應激狀態下QKI對細胞應激顆粒內具有m7G修飾mRNA的動態調控作用。

研究者首先驗證了METTL1-WDR4甲基轉移酶復合體對mRNA內部m7G的修飾作用。敲除METTL1/WDR4顯著降低small RNA和mRNA內部m7G的豐度；過表達野生型METTL1可增加small RNA和mRNA內部m7G的水平。除此之外，研究者還發現細胞質mRNA上的m7G總體豐度大于細胞核mRNA。為了篩選mRNA內部m7G修飾的特異性識別蛋白，研究者利用體外轉錄技術（in vitro transcription）合成了兩條僅含有G或m7G的單鏈寡核苷酸 (ssRNA) ，并將其與HepG2全細胞裂解液進行孵育，利用RNA pull down和質譜技術聯合分析，鑒定出能特異性識別m7G-ssRNA的RNA結合蛋白。eCLIP-seq數據庫分析結果表明，在QKI、IGF2BP2和LRPPRC這三個候選蛋白中，只有QKI含有與METTL1類似的GA-GA-基序（motif），正好是先前報道的mRNA內部m7G修飾基序。QKI是STAR蛋白家族的一員，主要包含QKI5、QKI6和QKI7三個亞型。細胞內（in cellulo）和細胞外（cell-free）RNA pull-down實驗表明QKI5、QKI6與QKI7均傾向與含有內部m⁷G修飾的ssRNA結合。接著研究者綜合分析了m7G甲基化RNA測序（MeRIP-seq）以及QKI5/QKI6/QKI7 RNA免疫共沉淀測序（RIP-seq）的數據，發現兩者都具有類似的GANGAN（N=A/C/U/G）基序。此外，METTL1敲除可以顯著抑制QKI與靶mRNA的結合，提示QKI與靶mRNA的結合至少部分依賴于METTL1所介導的內部m⁷G修飾。

此前的研究發現，活性氧和熱應激刺激可動態調控mRNA內部m7G修飾的水平，但其背后的機制并不明確。在各種應激源的刺激下，細胞質內RNA、蛋白翻譯復合物和RNA結合蛋白通過液-液相分離組裝成無膜細胞器結構，稱為應激顆粒（stress granule）。應激顆粒將特定的蛋白質和mRNA分子與細胞質分隔開來，對應激狀態下mRNA的代謝起到了關鍵的調節作用。G3BP1是上述應激顆粒中RNA-蛋白互作網絡中的核心調控分子。研究者通過免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光和鄰位連接技術（PLA）等檢測方法發現QKI6和QKI7可以與G3BP1發生相互作用。在正常情況下，具有m7G修飾的mRNA分布于細胞質內；而在應激狀態下，具有m7G修飾的mRNA會向應激顆粒內聚集。QKI 敲低顯著降低應激顆粒內具有m7G修飾mRNA比例，野生型QKI7過表達可以大體上恢復這一表型。

上述實驗結果提示，應激狀態下QKI可以識別并結合具有內部m7G修飾的mRNA，通過與G3BP1發生相互作用從而將靶mRNA限制在應激顆粒內。那么，QKI將靶mRNA攜帶至應激顆粒之后，對其代謝有何影響呢？

為了回答這一問題，研究者綜合分析了應激狀態下m7G MeRIP-seq、QKI7 RIP-seq以及SG RNA-seq的數據。測序結果同樣提示，具有m7G修飾并能與QKI7結合的mRNA更傾向在應激顆粒中聚集。KEGG通路分析表明這些基因多富集在“Hippo signaling pathway”和“pathway in cancer”兩個通路。接下來研究者開展了mRNA穩定性測序（mRNA stability profiling）和多聚核糖體分析（Polysome profiling），實驗結果表明，在應激狀態下QKI可以調控Hippo 信號通路關鍵基因等靶基因的穩定性和翻譯效率。

應激顆粒對腫瘤細胞在極端環境下的生存至關重要。長春新堿、紫杉醇、索拉菲尼等常用化療藥物均可誘導腫瘤細胞形成應激顆粒。TCGA數據庫分析表明，QKI與各種應激顆粒關鍵基因的表達均存在顯著的正相關性。研究者進一步研究發現阿霉素（doxorubicin）也可誘導腫瘤細胞形成應激顆粒，且QKI7與G3BP1共同定位于阿霉素誘導形成的應激顆粒中。體內外實驗表明，QKI7過表達可顯著增強腫瘤細胞對阿霉素的敏感性，提示應激顆粒對腫瘤化療耐藥的作用可能與mRNA內部m⁷G修飾有關。

綜上，該研究揭示了QKI作為mRNA內部m7G修飾識別蛋白的新功能，對應激顆粒內部mRNA的調控網絡提出了新的機制，并為靶向QKI/G3BP1從而優化腫瘤治療這一新策略提供了理論依據。