免疫組織化學和免疫細胞化學— 灌注固定法

出于多種考慮，將小組織片段簡單浸泡在固定液中便能得到合適的固定，對大多數組織來說可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是將固定液通過管道系統如心主動脈或腹部主動脈灌注到組織中。下面介紹一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多數器官的操作步驟。

材料

麻醉劑

手術用剪刀、鑷子、止血鉗

鋸齒小鑷子

手術刀

放置樣品的帶塞子的小瓶 (5-10ml)

0.9% 生理鹽水

500ml 燒杯

4% 多聚甲醛、固定液

手套、防護眼鏡

蠕動泵（或將燒瓶固定在距手術臺上方 150cm 處，口向下）

心主動脈灌注用輸液針，長 50mm，外徑 1.3-1.5mm

帶有靜脈輸血用的滴注腔的灌注裝置

心臟灌注固定法

1.設置蠕動泵，安裝灌注裝置和輸液針。首先，取 100ml 水沖洗管道除去管內殘留物，然后燒杯盛滿 4% 冷多聚甲醛（冰盒預冷），將灌注 管末端置入燒杯中。溶液體積應該與動物大小成比例，通常對于一只動物來說 100-200ml 足夠。打開閥門，調節到一個緩慢而穩定的速度 (20ml/min)，然后關閉閥門。

2.在操作臺上將剪刀、鑷子和止血鉗放在適宜操作的位置。給動物注射合適劑量的麻醉劑。動物一旦處于麻醉狀態后，將其背部向下放在操 作臺上?？梢允褂脦ё庸潭ù_保動物不動。

3.用捏反應法檢測麻醉程度。在開始下述操作之前確保動物是無反應的。

4.在腹部用手術刀沿著膈肌切一個口，用鋒利的剪刀剪開膈肌底部連著的組織，確保能進入胸腔。

5.取大號剪刀，鈍端向下，切穿左胸肋廓。

6.橫向切穿肋骨一到兩厘米，打開胸腔。用止血鉗打開，使心臟暴露出來。準備排血和輸液裝置。

7.用鑷子固定住心臟（心臟應該還在跳動），在左心室跳動部位直接插入針頭，垂直外露 5mm。注意針頭不要插入太多，以防刺破心室壁 影響溶液循環！用止血鉗將針頭固定在輸入口。打開閥門使 0.9% 的生理鹽水以緩慢、穩定的流速大約 20ml/min 輸入動物體內。

8.用剪刀在心房處剪一個口，保證溶液自由流動。如果溶液不能自由流出或溶液從動物的鼻孔或口腔流出，則要讓針頭復位。

9.當血液快排干時，換上 4% 多聚甲醛溶液（200-300ml）。

(換液時注意不要引入氣泡。灌注過程中最好帶上防護眼鏡，因為有時連接的管道會崩開使固定液噴射到眼睛里。)

當肝臟自發跳動（福爾馬林“跳舞”）及顏色變淺時表明灌注完成。（注：一般地，一只成年大鼠的灌注時間大約是 30-60 分鐘，但是根據 動物大小和技術的不同也有所差別）。

10.終止灌注，切除靶組織，放置盛有同種固定液的小瓶中，冰上或 4°C 固定 2 小時，再脫水包埋。4°C 浸泡過夜固定，效果更好。

腹主動脈灌注法

1.按上述方法準備材料和動物（步驟 1-3）。

2.在腹部正中橫向剪開一個長切口，打開腹腔，將腸道輕輕推至腹腔左側。

3.小心地將腎主動脈始端下方的主動脈露出。輕輕地將腹主動脈與覆蓋其上的脂肪組織及其它粘聯組織剝離開。

4.用小鑷子將主動脈壁牢牢地固定在距遠端 0.5-1.0cm 分叉處。然后將折針緊貼鑷子插入主動脈腔的近心端。

5.快速連續操作以下步驟:

a. 用小剪刀在下腔靜脈剪開一個口。

b. 灌注。

c.夾住膈肌下方腎主動脈始端上方的主動脈。

操作時，精確度和速度是非常重要的。因此，固定步驟最好兩個人操作。

灌注開始后迅速夾住主動脈至關重要，最簡單的方法就是用手指（帶手套）抵住腹腔的后壁壓住主動脈，

然后換上止血鉗。最后切除受壓上游的主動脈。

6.腎臟表面呈現顏色均一、變淺發白時表明灌注完成。灌注一只成年大鼠來說流速至少要控制在 60-100ml/min。灌注 3 分鐘。終止灌注，切 除并清理靶組織，并將之放置到盛有同種固定液的小瓶中（見后面的固定步驟），冰上或 4°C 固定 2 小時。4°C 浸泡過夜固定，效果更好。

7.脫水包埋組織。