免疫組織化學和免疫細胞化學—IHC/ICC 中的固定和通透技術

IHC/ICC 中的固定和通透技術

固定：

固定就是保持抗原細胞和亞細胞結構固定不動，同時又能使抗體進入到細胞和亞細胞的所有部位。固定和通透方法的選擇取決于抗原表位和 抗體本身的靈敏性，有時需要優化。

固定時可使用一些交聯試劑，如多聚甲醛，有利于保護細胞結構，但是可能會降低一些細胞成分的抗原性，因為交聯阻礙了抗體結合。鑒于 此，可采用抗原修復技術，尤其是固定孵育時間較長時或使用高百分比的交聯度固定劑時。另外一種選擇就是使用有機溶劑，但是它們會吸 去脂類使細胞脫水，同時會使蛋白沉淀在細胞架上。

1.4% 多聚甲醛

向玻片滴加 4% 多聚甲醛，維持 10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

(注意：在多聚甲醛中固定時間超過 10-15 分鐘會造成蛋白交聯，或許需要通過抗原修復技術來修復此交聯位點，

以確?？贵w能自由結合并檢測到該蛋白。）

2.乙醇

向玻片滴加 100-200μl 預冷的 95% 乙醇，5% 冰醋酸，維持 5-10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

3.甲醇

向玻片滴加 100-200μl 的冷甲醇。 -20°C 維持 10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

（注意：甲醇有通透作用。一些抗原表位對甲醇非常敏感，能破壞抗原表位結構。因此，如果需要通透，可用丙酮代替甲醇。）

4.丙酮

向玻片滴加 100-200 μl 的冷丙酮。 -20°C 維持 5-10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

（注意：丙酮也有通透作用，因此，不需要進一步通透。)

通透：

通透技術僅用于抗體需進入細胞內檢測蛋白時，包括細胞內蛋白和抗原表位位于胞內區的跨膜蛋白檢測。

溶劑：

1.丙酮固定也有通透作用。

2.甲醇固定也可通透，但不是總適用。

這些反應試劑都可用來固定和通透，也可在交聯劑如多聚甲醛固定后再使用。

去污劑：

1.Triton 或 NP-40

含 0.1-0.2% Triton 或 NP-40 的 PBS 洗滌 10 分鐘。

這些去污劑同樣也能溶解部分核膜，因此非常適合于核抗原染色。

(注意：因為這些都是強去污劑，因此當使用濃度較高或作用時間較長時會破壞蛋白，影響染色效果）

2.吐溫-20，皂角苷，洋地黃皂苷和 Leucoperm。

用0.2-0.5% 洗滌 10-30 分鐘。

這些是較溫和的細胞膜溶劑。它們會使細胞膜產生足夠大的孔，促使抗體進入細胞內而不用溶解胞膜。適合于胞漿內抗原質膜的

胞漿表面抗 原和可溶的核抗原。

特別建議：

用丙酮、乙醇或甲醛（高濃度）固定細胞骨架、病毒和一些酶抗原，可獲得理想的結果。

位于細胞器和胞漿顆粒上的抗原，其固定和通透方法的選擇取決于抗原本身，需盡量保留表位。