強大的基因組編輯工具——Crisp/cas9

      關于Crisp/cas9，這個是目前研究的一個大熱門，相關的文章和技術解析層出不窮，大家對什么是Crisp/cas9應該也有了一定的了解，今天就跟大家簡單的介紹一下相關的產品吧。不過首先，我們還是再過一遍Crisp/cas9的相關概念吧。

       一、 相關概念

    （1）CRISPR/Cas是什么？CRISPR是細菌中成簇存在的具有規律間隔的短回文重復序列，是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。cas 的全稱是CRISPR associated protein，它是一種通過crRNA引導的DNA內切酶，如果DNA底物與引導RNA互補，Cas就會裂解入侵的外源DNA。

    （2）CRISPR和Cas9共同組成了一套系統 ，CRISPR識別外源入侵的DNA，cas9負責剪切。是細菌或者古細菌的天然防御系統。而現今，被人類利用進行基因組編輯、轉錄擾亂、基因敲除、表觀遺傳調控等。

    （3）CRISPR-Cas系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活樣效應核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。

圖1來源https://www.jianshu.com/p/1e7bff7d5830

       二 、作用機理

      II型CRISPR系統中，CRISPR RNA（crRNA）與轉錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復合物能特異識別基因組序列，引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進行簡化?；蚪M的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對；靶序列末端的三核苷酸區域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識別位點，是實現剪切功能的關鍵。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的gRNA (guide RNA) 足以引導Cas9 對DNA的定點切割。

圖2 CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖

      通過介紹，我們了解了Crisp/cas9發揮切割作用的是cas9，起識別作用的是融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA。因此，要想做好Crisp/cas9這個實驗，我們必須要準備的試劑必須涉及sgRNA和cas9蛋白兩大方面。

       三、 產品推薦

      針對sgRNA和cas9，我們有如下產品可供選擇哦：

      1.sgRNA系列。

     （1）sgRNA載體類型

      *配合單獨表達Cas9 核酸酶(Cat.No.  CP-C9NU-01,  CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08,  CP-LvC9NU-09,  CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01,  CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。

      還有有上述貨號對應搭配使用的sgRNA亂序對照哦

     （2）還有sgRNA亂序對照慢病毒顆粒

      圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設計；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對照克隆（泳道2）轉染HEK293T細胞。轉染40h后收集細胞，提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進行PCR擴增，凝膠純化PCR產物，將純化后的產物與緩沖液混勻，經變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經PCR后的產物片段長度應為520bp，T7 ENI剪切后的產物應分別為330bp和190bp。

      圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因。實驗組（1-4泳道）為Cas9表達克隆及分別表達靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。對照組（5-8泳道）為Cas9表達克隆質及隨機sgRNA表達克隆的質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。通過T7核酸內切酶檢測分析基因組DNA各個靶點上同時存在的插入缺失。*號標記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個靶點的sgRNA都在目標靶點上有效地誘發了插入缺失突變（1-4道）。PCR產物條帶及T7核酸內切酶酶切產物條帶大?。篏FP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

     （3）sgRNA 文庫

      圖5. A：混合文庫篩選。對感染了sgRNA混合文庫的細胞株進行篩選，獲取具備目的表型的陽性細胞株進行Sanger測序識別對應的sgRNA，或通過深度測序搜索比例過高或過低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文庫array（獨立克隆文庫）進行基因敲除篩選。各板孔里的細胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒，并篩選具備目的表型的陽性細胞株。如此無需測序即可獲知與目的表型相關的sgRNA。

      人類 sgRNA 文庫相關產品

       2.Cas9系列產品

      （1）Cas9表達克隆產品

    （2）慢病毒顆粒類產品

     （3）GeneHero™ Cas9 穩定表達細胞系

     （4）GeneHero™ Cas9蛋白類產品

      圖6. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。針對HUWE基因設計3個sgRNA，分別與Cas9蛋白孵育后進行下一步切割實驗。紅點標注為切割后的DNA條帶，Ct為未切割的HUWE DNA片段

      圖7. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。sgRNA與Cas9蛋白孵育后進行切割實驗。GeneHero™ Cas9蛋白（3-5列）與IDT Alt-R® Cas9蛋白（6-7列）分別進行250ng，100ng和50ng稀釋反應。紅箭頭標注為切割后的DNA條帶，1列反應中只有Cas9，2列反應中只有sgRNA。

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