Cell子刊推薦：ADC位點特異性、高效穩定偶聯，細菌轉谷氨酰胺酶 (mTG) 來幫忙！

標題為“Site-specific antibody conjugations using bacterial transglutaminase and the Diels-Alder cycloaddition reaction”，作者為Thomas Nittoli等人，發表在《Cell Reports Physical Science》上，文章介紹了一種兩步連續的偶聯方法，結合了細菌轉谷氨酰胺酶/微生物谷氨酰胺轉氨酶（mTG， Microbial Transglutaminase）的位點特異性和Diels-Alder（DA）化學的穩定性，以生成具有良好物理化學性質的穩定抗體偶聯物。

抗體-藥物偶聯物（ADCs）已經成為一類強大的靶向生物制劑。目前所有11種美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的ADCs都是基于隨機偶聯的，但越來越多的證據表明，位點特異性ADCs有潛力提高治療指數。

傳統的制備方法仍存在一些局限性，需要進一步改進：

1. 隨機偶聯導致非均一性：傳統方法主要通過隨機偶聯將藥物連接到抗體上，這導致產物非均一性，藥物負載量（DAR）和抗體負載量（LAR）難以控制，影響 ADCs 的藥代動力學和藥效學特性。

2. 體外穩定性差：一些傳統方法，如硫醇-馬來酰亞胺偶聯，形成的硫代縮酮鍵在體內容易發生逆轉 Michael 加成反應，導致 ADCs 穩定性下降，藥物釋放提前，從而影響療效和安全性。

3. 聚集傾向增加：氨基酸殘基的修飾，如賴氨酸和半胱氨酸的偶聯，會增加 ADCs 的聚集傾向，導致免疫原性增強，安全性降低。

4. 制備過程復雜：一些傳統方法需要使用危險試劑或特殊條件，如疊氮化物和高能反應，這增加了制備過程的復雜性和成本，限制了大規模生產。

5. 藥效窗口有限：傳統方法制備的 ADCs 往往存在藥物釋放不理想的問題，導致藥物在腫瘤組織中的濃度不足或非靶組織暴露過多，限制了藥效窗口。

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TG（mTG, Microbial Transglutaminase）-DA 偶聯方法的優勢：

• 位點特異性： 通過 TG 酶（mTG, Microbial Transglutaminase）將藥物連接到抗體上的特定谷氨酰胺殘基，保證了藥物負載的均一性。

• 穩定性： DA 環加成反應形成的碳-碳鍵比酰胺鍵更穩定，減少了藥物過早釋放的風險。

• 反應條件溫和： 反應在水相中進行，無需使用危險試劑，安全性高。

• 親水性： 偶聯產物相對親水，降低了聚集的風險。

• 可擴展性： 可以用于多種藥物和抗體，并實現多種藥物負載模式。

• 雙偶聯： 利用分支二烯可以實現對抗體進行兩次偶聯，從而實現多種藥物負載模式。

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微生物谷氨酰胺轉氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase應用前景：

1、細胞毒性藥物 ADC：

1）抗腫瘤藥物： 將 MMAE、DM1、SN-38 等細胞毒性藥物偶聯到抗體上，用于靶向治療癌癥。 

2）免疫毒素： 將假單胞菌外毒素 (PE) 等免疫毒素偶聯到抗體上，用于靶向殺傷腫瘤細胞。

2、非細胞毒性藥物 ADC：

1）抗生素： 將利福平、萬古霉素等抗生素偶聯到抗體上，用于靶向治療細菌感染。 

2）抗真菌藥物： 將兩性霉素 B 等抗真菌藥物偶聯到抗體上，用于靶向治療真菌感染。

3）抗病毒藥物： 將利托那韋、達蘆那韋等抗病毒藥物偶聯到抗體上，用于靶向治療病毒感染。

3、其他應用：

1）熒光標記： 將熒光染料偶聯到抗體上，用于免疫熒光成像。 

2）放射性標記： 將放射性同位素偶聯到抗體上，用于放射免疫治療。

4、雙偶聯 ADC：

1）多種藥物負載： 將兩種或多種藥物偶聯到抗體上，用于提高治療效果或克服耐藥性。 

2）多靶點治療： 將兩種或多種抗體偶聯到藥物上，用于同時靶向多個腫瘤相關抗原。

5、定制 ADC：

1）根據患者個體差異設計 ADC： 例如，根據患者的腫瘤基因表達譜選擇合適的抗體和藥物進行偶聯。

2）開發新型的 ADC 平臺： 例如，將 TG-DA 偶聯方法與其他技術相結合，開發出更具特異性和安全性的 ADC。 

為什么選擇微生物谷氨酰胺轉氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase進行抗體偶聯？

• 位點特異性：mTG, Microbial Transglutaminase能夠催化特定的氨基酸殘基（如谷氨酰胺）與含有胺基的分子之間形成穩定的酰胺鍵。這種特異性使得TG在抗體偶聯中可以精確地在預定的位點引入藥物或其他分子，從而提高ADCs的均一性和療效。

• 穩定性：與傳統的隨機偶聯方法相比，mTG, Microbial Transglutaminase介導的偶聯可以生成更穩定的ADCs。這是因為mTG, Microbial Transglutaminase催化的反應生成的酰胺鍵在生理條件下非常穩定，不易被水解。

• 多功能性：mTG, Microbial Transglutaminase不僅能夠偶聯小分子藥物，還能夠偶聯各種不同的分子，如熒光標記、酶、甚至是其他蛋白質，這為開發多功能的生物制劑提供了可能。

• 反應條件溫和：mTG, Microbial Transglutaminase催化的反應通常在溫和的條件下進行，不需要極端的pH值或高能量的試劑，這有助于保持抗體的活性和穩定性。

• 可擴展性：mTG, Microbial Transglutaminase介導的偶聯方法具有很好的可擴展性，適合從小規模實驗室研究到大規模工業生產的轉換。

• 安全性：mTG, Microbial Transglutaminase作為一種酶，其催化的反應通常被認為是安全的，不會產生有害的副產品。

• Zedira公司的mTG, Microbial Transglutaminase：文章中特別提到使用了Zedira公司的TG，這可能是因為該公司提供的TG具有高純度和活性，或者具有特別適合于本研究的特定特性，如穩定性、特異性或易于大規模生產等。

• 創新性：使用mTG, Microbial Transglutaminase進行位點特異性偶聯是一種創新的方法，它允許研究者更精確地控制ADCs的設計，從而可能提高治療效果和減少副作用。

• 優化潛力：mTG, Microbial Transglutaminase的活性和特異性可以通過蛋白質工程進行優化，以適應不同的偶聯需求。

• 環境友好：使用酶作為催化劑通常被認為是一種環境友好的方法，因為它可以在水相中進行，減少了有機溶劑的使用。

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綜上所述，mTG, Microbial Transglutaminase的使用為抗體偶聯提供了一種高效、穩定且具有高度特異性的方法，有助于開發更安全、更有效的治療藥物。