Acti-stain555鬼筆環肽--免疫熒光的應用方案

鬼筆環肽是一種來自毒鵝膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能夠特異性且高親和力（解離常數 Kd 為 20 nM）地結合到聚合態肌動蛋白（F-肌動蛋白）上。鬼筆環肽可將肌動蛋白聚合的臨界濃度降低至不到 1 ?g/ml，從而作為一種聚合增強劑。鬼筆環肽已被標記上一種專有的紅色熒光染料（1），使其可用于染色組織培養細胞和組織切片（2，見圖 2）以及無細胞體系中的肌動蛋白絲。Acti-stain? 555 鬼筆環肽標記的肌動蛋白絲保留了許多未標記肌動蛋白的功能特性，包括它們與肌球蛋白相互作用的能力。

艾美捷Acti-stain555鬼筆環肽（#PHDH1-A）以紅色固體形式提供，分子量為 1775。對該化合物進行的吸收光譜和熒光掃描顯示，其吸收峰位于 550 nm，熒光峰位于 570 nm（見圖 1）。1×工作液的 PHDH1 足夠用于染色 300-350 片蓋玻片（22×22 mm）上的細胞（見圖 2）。  

注意：鬼筆環肽有毒，必須小心處理（人類 LD50 = 2 mg/kg）。  

圖 1：Acti-stain? 555 的吸收光譜和熒光掃描  

圖例：標記的鬼筆環肽被稀釋到甲醇中，其吸收光譜和激發光譜分別在 250-750 nm 和 550-750 nm 范圍內掃描。吸收峰位于 550 nm，熒光位于 570 nm。

圖 2：Swiss 3T3 細胞中的肌動蛋白應力纖維  

圖例：Swiss 3T3 細胞在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態，并用 Acti-stain? 555 鬼筆環肽和 DAPI（核染料）按方法描述進行固定和染色。細胞在配備 TRITC 濾光片組（535Ex/585Em 濾光片組）、數字 CCD 相機和 100×物鏡的熒光顯微鏡下觀察。注意細胞中遍布的肌動蛋白應力纖維（紅色）。

儲存與復溶  

短暫離心以使產品聚集在管底。用 500 ?L 100% 甲醇復溶，制備 14 ?M 的溶液。建議將溶液保存在 -20°C 的一個瓶中，可穩定保存 6 個月。凍干產品在 4°C 干燥條件下（濕度<10%）可穩定保存 6 個月。

應用 ：免疫熒光  

用于組織培養細胞中肌動蛋白絲熒光染色的方法有多種。固定程序對于獲得細胞內 F-肌動蛋白分布的真實表示至關重要。應根據實驗要求選擇固定方法。用甲醛或戊二醛固定組織培養細胞可獲得出色的肌動蛋白絲染色效果和良好的片狀偽足保存效果。

試劑  

1. Acti-stain? 555 鬼筆環肽（貨號：PHDH1）  

2. 在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態的 Swiss 3T3 細胞  

3. 要么從 Cytoskeleton, Inc. 購買 F-肌動蛋白染色試劑盒（貨號：BK005），要么準備以下 4-7 項試劑  

4. 磷酸鹽緩沖液（PBS，20 mM 磷酸鉀，pH 7.4，150 mM NaCl）  

5. 固定液（PBS 中的 3.7% 甲醛，pH 需調至 7.0）  

6. 通透緩沖液（PBS 中的 0.5% Triton X-100）  

7. 抗褪色封片介質（Fluka BioChemika，貨號：10981）  

8. PBS 中的 100 nM DAPI（4’6-二氨基-2-苯基吲哚）  

9. 顯微鏡載玻片（25×75×1 mm）  

10. 封片液（透明指甲油）

設備  

1. 熒光顯微鏡，配備用于 Acti-stain? 555 的 TRITC 激光激發濾光片（535±20 nm）和發射濾光片（585±20 nm），以及用于 DAPI 的激發濾光片（355±20 nm）和發射濾光片（440±20 nm）。  

2. 數字 CCD 相機。

Acti-stain555鬼筆環肽文獻參考：

1. Wulf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.

2. Kron, S.J. et al. (1991).  Meth. Enzmol. 196: 399-416.