SiR-DNA試劑盒：細胞準備、染色與成像方案

SiR-DNA基于硅羅丹明（SiR）熒光團和DNA小溝結合劑雙苯咪唑（Hoechst）。SiR-DNA可在活細胞中特異性地標記DNA，背景低（1）。SiR-DNA的關鍵特性包括：i）遠紅光吸收和發射波長；ii）細胞通透性；iii）熒光生成特性；iv）與超分辨率顯微鏡技術（STED和SIM）兼容。這些特性在一個探針中的獨特組合使SiR-DNA處于卓越的前沿。

艾美捷SiR-DNA試劑盒（#CY-SC007）物理性質：

-吸收波長（Abs）：652nm

-發射波長（Em）：674nm

-最大摩爾吸光系數（εmax）：1.0×10?mol??·cm??

-分子量（MW）：950.2g/mol

-分子式（MF）：C56H59N9O4Si

儲存與操作

收到后請將化合物保存在-20°C以下。使用無水DMSO配制化合物溶液。使用后請將溶液保存在-20°C以下。在打開小瓶之前，應讓其恢復至室溫。如果儲存得當，化合物應可在數月內保持穩定。注意：DMSO溶液應特別小心處理，因為DMSO已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關當地法規處理這些試劑。

標記協議：

注意：本協議是使用貼附在蓋玻片上的人類成纖維細胞優化的，并已在其他常見細胞系中得到確認。實驗協議的建議應作為起點，每種細胞類型的最優標記條件應通過實驗確定。SiR-DNA基于DNA小溝結合分子雙苯咪唑。因此，它可以改變活細胞中的DNA代謝。在高達10?M的SiR-DNA濃度下，有絲分裂持續時間和染色體錯誤分離保持不變。然而，一項獨立研究（1）使用CyclinB1和γH2AX報告基因檢測建議，如果計劃進行長期（>12小時）成像實驗，建議使用250nM或以下濃度的SiR-DNA。對于所有其他用途，建議使用1-3?M的SiR-DNA進行染色。

配制1mM儲備液：

將SiR-DNA小瓶中的內容物溶解在50?L無水DMSO中，制備1mM儲備液。此溶液應保存在-20°C或以下。不要將溶液分裝成小份量，因為它們會更快降解，且該化合物不會因多次凍融循環而改變。如果儲存得當，此儲備液應可在三個月或更長時間內保持穩定。如果需要精確測定儲備液的濃度，將1?L1mM儲備液稀釋在含有0.2%SDS的99?LPBS中。在室溫下靜置15分鐘后，測量652nm處的吸光度。使用上述摩爾吸光系數計算濃度。

配制染色液：

將SiR-DNA稀釋到所需的濃度，加入細胞培養基（例如DMEM+10%胎牛血清）中，并短暫渦旋。由于染色效率可能因細胞系而異，建議首次嘗試時使用3?M的濃度，以快速獲得強染色效果，然后在后續實驗中逐步降低SiR-DNA的濃度，直至達到最佳染色效果（見下表中的標記濃度和孵育時間）。某些細胞系可能表達高水平的外排泵，導致SiR-DNA染色效果不佳。在染色液中加入1-10?M的維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通常會顯著改善染色效果。

細胞準備與染色：

按照常規方法在蓋玻片、玻璃底培養皿或玻璃底多孔板上培養細胞。當細胞達到所需密度時，用染色液替換培養基，確保所有細胞都被溶液覆蓋。將細胞置于37°C、含5%CO?的濕潤環境中孵育，并根據下表確定標記時間與探針濃度的關系：

注意：SiR-DNA可以對用甲醛（PFA）和甲醇固定的細胞進行染色。

細胞成像：

SiR-DNA的成像最好使用標準的Cy5設置。標記后，活細胞可以立即成像，無需洗滌步驟?？蛇x地，用不含探針的新鮮培養基替換一次標記液，通?？梢蕴岣咝旁氡?。如果進行時間序列成像，建議在整個實驗過程中將探針濃度保持在1?M或以下，以獲得穩定的信號并避免探針對DNA代謝產生干擾。如果在成像前對細胞進行了洗滌，染色效果可維持數小時。請注意，SiR-DNA可能會被360-390nm的光激發，并由于探針的DNA結合部分的熒光而在大約450nm處產生一些熒光。

SiR-DNA試劑盒文獻參考：

1. Sen, Onur, Adrian T. Saurin, and Jonathan MG Higgins.; Scientific reports 8.1 (2018): 7898