可定制的高通量PROTAC體外泛素化測定試劑盒

泛素與泛素偶聯機泛素是一種小多肽，可以通過其C末端與賴氨酸的胺基結合靶蛋白上的殘基。這種結合被稱為單泛素化。附加泛素部分可以利用存在的七個賴氨酸殘基中的任何一個與該初始泛素綴合在泛素中。這些泛素鏈的形成被稱為多泛素化。最井這種多泛素化的特征是通過泛素（K48）48位的賴氨酸形成鏈-鏈接的鏈）。單泛素化已被證明可以改變靶蛋白。多泛素化最普遍的結果是蛋白酶體介導的靶蛋白的降解。

泛素與靶蛋白的結合需要三種不同連接酶的協同功能，E1（泛素激活酶）、E2（泛素偶聯酶）和E3（泛素連接酶）產生在泛素的C末端和e-賴氨酸的氨基靶蛋白上的殘基。泛素E3連接酶作為支架蛋白，為泛素結合酶（E2）和靶底物。通常，E3連接酶介導轉移泛素從E2硫酯中間體到與底物蛋白的酰胺連接（Hershko和Ciechanover，1998）。除了底物的泛素化，E3連接酶還可以“自動”泛素化”本身。

PROTACs（針對嵌合分子的蛋白質水解）人為劫持UPS的成分降解靶蛋白。PROTAC藥物是含有兩個通過連接體連接的功能配體；一個配體與靶蛋白結合，另一個配體結合至E3連接酶。理論上，將這兩個實體接近會導致多泛素化和靶蛋白的蛋白酶體降解。然而，考慮到這種情況的復雜性PROTAC發現策略面臨著一些挑戰和陷阱。電流在評估PROTAC時，分析解決了許多這些挑戰，并作為一種有效報告的工具通過監測PROTAC介導的泛素化來實現真正的PROTAC效率。

體外泛素化試劑盒以建立一種高通量方法通過監測蛋白質獲得泛素化的內在能力來準確預測PROTAC的效率。我們提供了三種E3泛素連接酶Cereblon、VHL和HDM2的試劑盒，以監測PROTAC介導的選擇目標的泛素化。在測定的核心，微量滴定板條，預先涂有專有的TUBE試劑（測定板）用于捕獲PROTAC依賴性反應。對于測定，首先將PROTAC加入測定板中，然后加入E3連接酶和靶蛋白，使三元復合物形成。作為一個序列步驟，將含有wt泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中以啟動PROTAC介導的泛素化。在反應過程中，E1-E2-E3產生的多泛素鏈機器被識別并捕獲在井中。在反應和隨后的洗滌之后步驟，分離的多泛素化產物與針對感興趣的蛋白質的抗體（不是包括）和與HRP綴合的第二抗體（包括），允許通過化學發光。因此，在這種情況下，由捕獲的多泛素化產物產生的信號“夾心”ELISA樣測定是PROTAC活性的定量測定。此外檢測策略不需要額外的非天然標記或泛素標記可能導致實驗性偽影。

建議用途：

1.檢測PROTAC和分子膠（MGs）的活性。

2.比較多種PROTAC變體，并從UbMax中建立預測DC50。

3.選擇所有三種連接酶來比較PROTACs/MGs活性以證明選擇性。

4.檢測PROTAC底物特異性和異構體選擇性。

艾美捷PROTAC體外泛素化測定試劑盒#PA-0770-P100組件：

1.體外泛素化測定板

注意：不要將分析板快速解凍至室溫。我們建議最初放置

在轉移至室溫之前，將測定板在4°C下放置30分鐘。

2.10X含量測定緩沖液

尺寸：1.2毫升

注：添加b-巰基乙醇新鮮至1X測定緩沖液中1mM的最終濃度。

3.E3混合（2X）

尺寸：1 x 250?l（20X）

注：在提供的E3混合物中加入濃度在40-80nM之間的目標蛋白

以促進與PROTAC和E3連接酶形成三元復合物。

4.E1-E2-泛素混合物（2X）

尺寸：1 x 250?l（20X）

5.第二抗體（抗小鼠或抗兔HRP綴合物）

尺寸：60?L（100X）

6.檢測試劑1和2

尺寸：1 mL檢測試劑1和1 mL檢測劑2

7.堵劑精礦（5X）

尺寸：5毫升

8.陽性對照試劑

二甲基亞砜中的PROTAC（50X）：10?L（MZP54，dBET6，A1874）

靶蛋白陽性對照BRD3（20X）：20?L

抗BRD3抗體（100X）：5?L

抗小鼠HRP綴合物（100X）：5?L

PROTAC?體外泛素測定試劑盒：可定制的泛素連接酶試劑盒

1.洗滌緩沖液

a.1倍磷酸鹽緩沖鹽水，0.1%吐溫（PBST）

2.具有發光功能的讀板器

3.b-巰基乙醇

4.100mM ATP

5.正在研究的PROTAC、靶蛋白和靶特異性抗體（ELISA兼容）

6.聚丙烯板（可選）

7.多通道移液器和自動洗板器（可選）

8.15 mL離心管