PROTAC檢測板試劑盒測定實例分析

LifeSensors的PROTAC檢測板試劑盒用于泛素化的相對測定PROTAC處理后細胞裂解物中靶蛋白的表達。此檢測旨在取代更費力的半定量蛋白質印跡方法來檢測多泛素化和靶蛋白在細胞中的降解，并提供定量和可重復的結果。此外，該測定允許高通量篩選以處理化合物文庫和建立秩序效價幫助化學家建立SAR。這塊板是為研究而設計的僅使用，不用于人類或動物的診斷或治療應用。

艾美捷PROTAC檢測板試劑盒#LSS-PA-0950-0096檢測原理：

Assay Plate是一種基于三明治的檢測方法，其中來自細胞裂解物被捕獲在預涂微量滴定板的孔中，使用專有的多泛素結合試劑。未被多泛素化/未結合的蛋白質通過洗滌，然后加入針對靶蛋白的抗體，然后洗滌。最后，使用與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的第二抗體來測量

結合的目標抗體與檢測試劑和發光微孔板讀取器。

PROTAC檢測板試劑盒組件：

涂層板： 一個預包被和封閉的 96 孔試紙 PROTAC 檢測板（儲存在 -80°C)

封閉濃縮物（BC）： 12 mL 用于抗體稀釋的 5X 封閉劑（儲存在 4°C)

塑料板密封： 雙板密封

檢測試劑 1 （DR1）： 1.0 mL DR1 試劑瓶（儲存在 4°C)

檢測試劑 2 （DR2）： 1.0 mL DR2 試劑瓶（儲存在 4°C)

MG132： 25 μL 小瓶（DMSO 中為 10 mM;儲存在 -20°C)

PR-619： 25 μL 小瓶（DMSO 中為 22 mM;儲存在 -20°C)

1，10-菲咯啉： 100 μL 小瓶（DMSO 中為 500 mM;儲存在 -20°C)

協議：

1.從冰箱中取出盤子，從冰箱中取下試劑，使其達到室溫（RT）。所有孵育均在室溫（22°-27°C）下進行。為避免交叉污染，請勿重復使用銘牌密封劑。

2.制備細胞裂解物，并使用用PBS稀釋的15-20?g/孔（Vt=50-100?l/孔）。

3.在室溫下搖動培養板2小時。

4.帶PBST的洗滌板（4 x 180mL/井）。最后一次洗滌后，輕輕去除最后一滴緩沖液在紙巾或其他吸墨紙上輕拍盤子（倒置）。不允許井完全干燥。

5.在1x封閉劑中稀釋一次抗體（稀釋取決于一次抗體的效率；良好開始稀釋為1?g/mL），加入50-100?L/孔，并在室溫下振蕩培養板1小時。

6. 按照上述步驟重復洗滌（參見步驟4）。

7. 在1x封閉劑中稀釋第二HRP綴合的抗體（根據制造商），加入50-100?L/孔，在室溫下搖動培養板1小時。

8. 按照上述步驟重復洗滌（參見步驟4）。

9. 使用前，將800?L DR1和800?L DR 2混合到10 mL超純水（去離子或蒸餾）。向每個孔中添加50-100?L該溶液，并使用針對化學發光5-10次，間隔1分鐘。

注意事項：

1.為了監測目標蛋白的多泛素化及其降解，并且在PROTAC的Dmax之后。

2.通過蛋白質印跡優化抗體稀釋度和靶蛋白的特異性。目標的選擇抗體應該適用于基于夾心ELISA的測定。

3.根據目標豐度優化裂解物濃度。

4.參見下面建議的裂解緩沖液，以具有目標蛋白的最佳多泛素化譜。

5.包括最佳結果和解釋的適當控制

細胞裂解方案：

1.完全吸取培養基，并用冰冷的1X PBS沖洗細胞。用1X適當刮除單元格PBS，離心以沉淀細胞并除去PBS。

2.在-80°C下冷凍細胞沉淀以長期儲存或在冰上進行裂解。

3.加入RIPA裂解緩沖液（顆粒體積的5-10倍，即100mL顆粒添加500-1000?L裂解緩沖器）。間歇性渦旋10-15分鐘，同時將樣品保持在冰上以進行有效的裂解。

4.在4°C下以13000 xg離心15-20分鐘。

5.收集上清液（裂解物）并使用標準方法測定蛋白質濃度。

PROTAC檢測板試劑盒測定實例：

圖1：（A） Jurkat細胞未經處理（DMSO）或用dBET1 PROTAC（0.01-12.0μM）處理45分鐘。按照PROTAC測定板。結果表示為平均化學發光度的倍數變化±標準偏差（n=3）。

（B） 對如（A）中處理的Jurkat細胞的細胞裂解物（25μg）進行BRD3和β-肌動蛋白的免疫印跡。蛋白酶體抑制劑MG132用作對照以防止BRD3降解。

圖2：（A） 用dBET1 PROTAC（1μM）處理Jurkat細胞不同時間（0-120分鐘）。細胞裂解物（15μg/孔）按照PROTAC測定板手冊中所述進行處理。結果表示為平均化學發光強度的倍數變化±標準偏差（n=3）。

（B） 對如（A）中處理的Jurkat細胞的細胞裂解物（25μg）進行BRD3和β-肌動蛋白的免疫印跡。蛋白酶體抑制劑MG132用作對照以防止BRD3降解。

圖3：（A-B）用PROTAC（1μM）處理K562細胞不同時間。細胞裂解物（15μg/孔）按照手冊中所述進行處理PROTAC測定板（目錄號PA950）。結果表示為平均化學發光度的倍數變化±標準偏差（n=3）。

（C） 對來自如（A）中處理的K562細胞的細胞裂解物（25μg）進行BTK和AURKA的免疫印跡。使用MG132作為對照（最后一條車道）。