谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒檢測步驟和結果分析

谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）是一種幫助維持氧化還原平衡并抵御氧化應激的酶。GPx催化還原H?O?和有機氫過氧化物，以谷胱甘肽作為輔底物，防止活性氧（ROS）的積累，從而避免對蛋白質、脂質和DNA造成損傷。GPx廣泛分布，尤其在代謝活躍的器官（如肝臟、腎臟、肺部和紅細胞）中含量豐富。其表達水平受環境因素調節，包括飲食中的硒和氧化應激水平。GPx缺乏與多種病理狀況相關，包括神經退行性疾病、心血管疾病、癌癥和年齡相關性黃斑變性。AkrivisBio的谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測試劑盒是一種簡單、靈敏的檢測方法，能夠評估多種樣本中的GPx活性，靈敏度低于每孔0.2毫單位。

艾美捷谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒：

貨號：MA-0137

規格：100孔

樣本類型：組織提取物、細胞裂解液、血清、尿液、血漿及其他生物液體

適用物種：所有

檢測方法：比色法，吸光度450納米

檢測類型：定量檢測

應用：一種基于微孔板的比色法檢測方法，用于在多種樣本中測量谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性，靈敏度低于每孔0.2毫單位。

靈敏度：低于0.2毫單位/孔

儲存條件：-20°C

運輸溫度：冰凝膠包運輸

保質期：自發貨之日起一年

谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒檢測原理：

1.在還原型谷胱甘肽存在的情況下，GPx還原添加的枯烯氫過氧化物，過程中生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

2.谷胱甘肽還原酶將GSSG還原回谷胱甘肽的還原型（GSH），同時將NADPH轉化為NADP。

3.通過在340納米處監測反應，直接跟蹤NADPH的減少。

檢測試劑：

-檢測緩沖液：50毫升（MA-0137A）

-NADPH：凍干粉，藍色試劑瓶（MA-0137B）

-谷胱甘肽還原酶：2微升，綠色試劑瓶（MA-0137C）

-還原型谷胱甘肽（GSH）：凍干粉，琥珀色試劑瓶（MA-0137D）

-枯烯氫過氧化物：2微升，黃色試劑瓶（MA-0137E）

-GPx陽性對照：凍干粉，紅色試劑瓶（MA-0137F）

儲存和處理：

未開封的試劑盒應儲存于-20°C。使用前將檢測緩沖液恢復至室溫。打開前將所有小瓶短暫離心數秒。

-檢測緩沖液：即用型，儲存于4°C。

-NADPH：用0.5毫升去離子水溶解。儲存于-20°C。

-谷胱甘肽還原酶：用220微升檢測緩沖液溶解。使用時置于冰上。儲存于-20°C。

-還原型谷胱甘肽：用220微升檢測緩沖液溶解。使用時置于冰上。儲存于-20°C。

-枯烯氫過氧化物：用1.25毫升檢測緩沖液溶解。儲存于4°C。

-谷胱甘肽過氧化物酶陽性對照：用100微升檢測緩沖液溶解。使用時置于冰上。儲存于-20°C。

-在使用過程中，所有含有酶的物質（樣本、谷胱甘肽還原酶、GPx陽性對照）應置于冰上。

檢測步驟：

1.標準曲線：將25微升NADPH溶液轉移至975微升去離子水中，得到1毫摩爾/升NADPH溶液。將0、20、40、60、80、100微升的1毫摩爾/升NADPH溶液分別加入96孔板中，分別得到0、20、40、60、80、100納摩爾。用檢測緩沖液將所有孔的體積調整至100微升。在340納米處測量吸光度，繪制標準曲線。

2.樣本準備：在冰上將組織（10毫克）、細胞（10?個）或紅細胞（100微升沉淀）在100微升檢測緩沖液中勻漿化。在4°C下以16,000×g離心5分鐘；將清亮的上清液轉移至新的試管中并置于冰上。直接將血清轉移至孔中。將樣本的2-50微升轉移至96孔板的孔中。用檢測緩沖液將所有孔的體積調整至50微升。

注意：NADPH不穩定，容易被多種酶降解。未立即分析的樣本應儲存于-80°C或更低溫度。所有樣本讀數必須落在標準曲線范圍內。任何低于約0.3-0.4吸光度的樣本讀數都可能處于非線性范圍內，應稀釋后重新檢測。

3.陽性對照和背景對照：將5微升GPx陽性對照轉移至一個孔中，并用檢測緩沖液調整至50微升。將50微升檢測緩沖液轉移至一個孔中作為背景對照，以校正可能發生的任何非GPx導致的NADPH損失。

4.準備反應：每個反應需要40微升預反應混合液。

5.啟動反應：向測試樣本和陽性對照（不要向背景對照孔）中加入10微升枯烯氫過氧化物以啟動反應。

6.測量：在25°C下，在340納米處動力學監測反應，時間足夠長以建立反應的線性速率。

注意：在加入枯烯氫過氧化物之前，測試和陽性對照孔在15分鐘預孵育后的初始340納米吸光度應大于1.0。如果讀數小于1.0，意味著樣本中要么GPx含量過高（稀釋后重新檢測），要么GSSG含量過高。可以通過使用10千道爾頓離心過濾器從樣本中去除小分子來減少高GSSG。

7.典型結果：

8.計算：從所有標準品中減去0標準品的值。繪制標準曲線。確定標準曲線的斜率。確定背景對照和測試孔的斜率。這些通常由于初始滯后和由于底物耗盡而后期減緩，呈現出輕微的S形。確定測試樣本線性中間部分的斜率，并減去背景對照的斜率以校正非GPx貢獻。將校正背景后的斜率除以標準曲線的斜率，得到每孔樣本的斜率（納摩爾/分鐘，即毫單位）。要將結果換算回每單位樣本的毫單位：

-A.將每孔的毫單位除以加入孔中的樣本體積=每微升樣本的毫單位。

-B.將每微升樣本的毫單位乘以上述步驟2中離心后獲得的上清液總體積=樣本中總GPx的毫單位。

-C.將樣本中的總GPx除以組織毫克數或細胞數量等=每毫克（或細胞數量等）的GPx活性毫單位。

僅用于研究！