琥珀酸測定試劑盒--準確測定低于25微摩爾的琥珀酸

琥珀酸是三羧酸循環中的一個重要代謝產物。  

它處于一個關鍵節點，提供FADH?，從而將電子引入細胞呼吸過程中的電子傳遞鏈。琥珀酸由乙酰輔酶A和草酰乙酸通過檸檬酸合酶生成，并在生成FADH?的過程中轉化為延胡索酸。琥珀酸還作為一種信號分子，參與多種細胞過程，包括炎癥、缺氧反應和基因表達調控。在缺血等病理條件下，琥珀酸會積累，損害線粒體功能，并促進氧化應激和組織損傷。AkrivisBio的琥珀酸檢測法是一種簡單、靈敏的定量檢測方法，能夠準確測定低于25微摩爾的琥珀酸。

艾美捷琥珀酸測定試劑盒：

貨號：MA-0134

規格：100孔

樣本類型：細胞裂解液、組織提取物

適用物種：所有

檢測方法：比色法，吸光度450納米

檢測類型：定量檢測

應用：一種基于微孔板的比色法檢測方法，用于在多種樣本類型中定量檢測低于25微摩爾的琥珀酸。

靈敏度：低于25微摩爾

儲存條件：-20°C

運輸溫度：冰凝膠包運輸

保質期：自發貨之日起一年

琥珀酸測定試劑盒檢測原理：

1.在ATP和輔酶A存在的情況下，琥珀酰輔酶A合成酶將琥珀酸轉化為琥珀酰輔酶A，同時生成ADP。  

2.己糖激酶利用ADP將葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸。  

3.葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化，將NAD轉化為NADH。  

4. NADH用于還原四氮唑，生成具有最大吸收波長為450納米的高色素甲臜。

檢測試劑：

-檢測緩沖液：25毫升  

-琥珀酰輔酶A合成酶：凍干粉，紫色試劑瓶  

-己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶：凍干粉，綠色試劑瓶  

- ATP/輔酶A/葡萄糖：凍干粉，藍色試劑瓶  

- WST-8試劑：凍干粉，紅色試劑瓶  

-琥珀酸標準品：凍干粉，黃色試劑瓶  

儲存和處理：

使用前儲存于-20°C。使用前將檢測緩沖液恢復至室溫。打開前將所有小瓶短暫離心數秒。  

-檢測緩沖液：即用型，儲存于-20°C。  

-琥珀酰輔酶A合成酶、己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ATP/輔酶A/葡萄糖：用220微升檢測緩沖液溶解。如果檢測需要多次使用，可分裝成小份量并儲存于-20°C。使用時置于冰上。  

- WST-8試劑：用220微升去離子水溶解。儲存于-20°C。  

-琥珀酸標準品：用100微升水溶解，得到40毫摩爾/升溶液。儲存于-20°C。使用時置于冰上。

檢測步驟：

1. 將微孔板讀取器預熱至37°C。  

2. 標準曲線：將10微升標準品轉移至990微升去離子水中，得到0.4毫摩爾/升溶液。將0、5、10、15、20、25微升的標準溶液分別轉移至96孔板的一系列孔中，分別得到0、2、4、6、8、10納摩爾琥珀酸。用琥珀酸檢測緩沖液將所有孔的體積調整至50微升。  

3. 樣本準備：將組織（10毫克）或細胞（10?個）直接在100微升檢測緩沖液中勻漿化。以16,000×g離心以去除顆粒物。將清亮的上清液轉移至新的試管中。將每個樣本的5-50微升轉移至96孔板，并用檢測緩沖液將所有孔的體積調整至50微升。  

注意：  

a. 該反應涉及輔酶A。涉及輔酶A的反應表現出輔酶A酯的非酶促水解，導致無效循環，從而產生較高的背景漂移。所有樣本和標準品將以相同的速率漂移，從含有琥珀酸的樣本中減去0標準和/或背景對照可以校正背景漂移。  

b. 樣本中的NADH會產生背景。將此類樣本雙份運行，使用配對孔作為背景對照。  

c. 使用1%（重量/體積）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）對有色樣本（例如葡萄酒）進行脫色處理。孵育5分鐘，然后通過10千道爾頓離心過濾器過濾。  

4. 啟動反應：根據要檢測的樣本和標準品數量準備足夠的反應混合液。每個孔需要50微升反應混合液，包含以下成分：  

- 反應混合液：檢測緩沖液42微升，琥珀酰輔酶A合成酶2微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶2微升，ATP/輔酶A/葡萄糖2微升，WST-8試劑2微升。  

- 背景對照混合液：檢測緩沖液44微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶2微升，ATP/輔酶A/葡萄糖2微升，WST-8試劑2微升。  

將50微升反應混合液加入含有標準品和樣本的每個孔中，混合均勻。  

5. 測量：在37°C下，用微孔板讀取器在450納米處監測反應30-60分鐘，直到所有孔的吸光度平行漂移。  

6. 典型結果  

7. 計算：從所有標準品讀數中減去0標準品讀數。繪制標準曲線并確定標準曲線的斜率。該斜率定義了測量系統的吸光度/納摩爾。如果運行了背景對照，則從配對樣本中減去這些值，否則從0標準品的背景值中減去。將校正背景后的樣本值除以標準曲線的斜率，以獲得樣本孔中琥珀酸的納摩爾數。要將結果換算回每單位樣本中的琥珀酸納摩爾數：  

- A. 將樣本孔中的琥珀酸納摩爾數除以加入孔中的樣本微升數 = 樣本中琥珀酸納摩爾/微升。  

- B. 將樣本中琥珀酸納摩爾/微升乘以離心步驟后新鮮試管中超氧化物歧化酶的總體積 = 樣本中琥珀酸的總納摩爾數。  

- C. 將樣本中琥珀酸的總納摩爾數除以組織毫克數（或細胞數量等） = 每毫克組織（或細胞數量等）中的琥珀酸納摩爾數。