輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測定試劑盒-低至100皮摩爾水平定量檢測

NADP和NADPH在代謝和氧化還原反應中發揮著關鍵作用。NADP作為多種酶促反應的輔酶，尤其在光合作用和抗氧化應激防御中起重要作用。NADPH是NADP的還原形式，對生物合成反應（如脂肪酸和核苷酸合成）至關重要。此外，NADPH作為一種強還原劑，保護細胞免受氧化損傷并維持氧化還原平衡。NADP和NADPH之間的動態相互作用對細胞功能和整體代謝平衡不可或缺。AkrivisBio的NADP/NADPH檢測試劑盒是一種簡單、靈敏的比色法檢測方法，能夠在多種生物樣本中低至100皮摩爾水平定量檢測NADP和/或NADPH。

艾美捷輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測定試劑盒：

貨號：MA-0126

規格：100孔

樣本類型：細胞裂解液、組織裂解液

適用物種：所有

檢測方法：比色法，吸光度450納米

檢測類型：定量檢測

應用：一種基于微孔板的比色法檢測方法，用于在多種生物樣本中測量NADP和/或NADPH水平。

靈敏度：100皮摩爾

儲存條件：-20°C

運輸溫度：冰凝膠包運輸

保質期：自發貨之日起一年

輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測定試劑盒檢測原理：

1.樣本中存在的NADP被特異性的NADP依賴型乙醇脫氫酶轉化為NADPH。

2.NADPH用于還原一種近乎無色的四氮唑鹽，生成高度有色的甲臜。在此過程中，NADPH被重新轉化為NADP。

3.通過在選定緩沖液中適當pH下孵育，可以選擇性地破壞樣本中的NADP，而不影響NADPH。

輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測定試劑盒內容：

-提取緩沖液：50毫升（MA-0126A）

-循環緩沖液：15毫升（MA-0126B）

-乙醇脫氫酶：0.2毫升（綠色，MA-0126C）

-WST試劑：凍干粉（紫色，MA-0126D）

-終止液：1.2毫升（紅色，MA-0126E）

-NADPH標準品：凍干粉（黃色，MA-0126F）

用戶自備材料：

-PBS

-DMSO

-10kDa分子量截止離心過濾器

儲存和處理：

-未開封的試劑盒應儲存于-20°C。

-打開前將所有小瓶短暫離心數秒。

-使用前將試劑盒組分恢復至室溫。

-提取緩沖液和循環緩沖液：即用型，儲存于4°C。

-乙醇脫氫酶：使用時置于冰上。如果試劑盒將在幾周內多次使用，可分裝成小份量并儲存于-20°C。

-WST試劑：用1.2毫升去離子水溶解。靜置2分鐘后輕輕振蕩以溶解。儲存于4°C。

-終止液：即用型，儲存于4°C。

-NADPH標準品：用200微升DMSO溶解。儲存于4°C。

檢測步驟：

1.標準曲線：將NADPH標準品稀釋至0.4微摩爾/升（將10微升標準品轉移至含有990微升提取緩沖液的試管中，得到4皮摩爾/微升NADPH）。將稀釋后的NADPH標準品0、5、10、15、20、25微升分別轉移至96孔板的一系列孔中，雙份進行，分別得到0、20、40、60、80和100皮摩爾/孔。用提取緩沖液將所有孔的體積調整至50微升。

注意：稀釋后的NADPH溶液不穩定，必須在幾小時內使用。細胞或組織裂解后的NADPH易因多種酶的存在而降解。通過以下方法可以更好地保存NADP/NADPH：將裂解樣本通過10kDa分子量截止濾器過濾，或使用我們的樣品脫蛋白試劑盒沉淀蛋白（確保最終溶液呈中性或堿性）。

2.樣本準備：

-細胞：用冰冷的PBS洗滌細胞（4×10?個）或組織（50毫克）。以2000×g離心5分鐘收集洗滌后的細胞。移除上清液，加入800微升提取緩沖液，混合后置于冰上10分鐘。以16,000×g離心，將上清液轉移至新的試管中。

-組織：用500微升提取緩沖液勻漿化，置于冰上10分鐘。以16,000×g離心10分鐘，將上清液轉移至新的試管中。

-總NADP+NADPH檢測：將50微升提取后的樣本轉移至96孔板的孔中，雙份進行。

-僅檢測NADPH：將200微升每個樣本轉移至微量離心管中，在60°C下加熱30分鐘以分解NADP。在此條件下，NADP被選擇性分解。冷卻至冰上。如有沉淀，短暫離心樣本。將50微升每個樣本轉移至96孔板的孔中，雙份進行。

3.啟動反應：每個孔需要100微升反應混合液。根據要檢測的孔數準備足夠的反應混合液。

-循環緩沖液：98微升

-乙醇脫氫酶：2微升

混合均勻后，將100微升混合液加入每個孔中。讓孔板靜置5分鐘，以將NADP轉化為NADPH，然后再啟動循環反應。

4.向每個孔中加入10微升WST試劑并混合。

5.測量：在室溫下，以動力學模式在450納米處監測反應，最長可達4小時。

注意：這是一個動力學檢測，反應速率與NADPH的量成正比。如果需要，可以通過向每個孔中加入10微升終止液來停止反應。反應停止后，顏色在密封孔板中可穩定保持24-48小時。

6.典型結果：

7.計算：使用固定時間點的值或通過確定各個反應的斜率，從所有標準品和樣本中減去0標準品的值。仔細檢查動力學曲線，并選擇僅包含吸光度隨時間線性增加的時間范圍。隨著吸光度的增加，反應速率趨于下降，導致反應進程呈現向下曲線。將標準曲線繪制為吸光度或斜率與NADPH皮摩爾的關系。標準曲線的上端出現凸起，顯示出輕微的非線性，不在直線上的點應被排除。將標準曲線的斜率應用于每個樣本，即將樣本值除以標準曲線的斜率。