兔抗53BP1免疫組化抗體親和純化，跨物種識別人/小鼠組織，使用FFPE及冰凍切片

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人及小鼠53BP1（p53結合蛋白1）的兔源多克隆抗體（貨號IHC-00001）的完整技術參數，并重點針對免疫組織化學（IHC）應用提供標準化操作流程與優化建議。該抗體適用于DNA雙鏈斷裂修復、基因組穩定性及腫瘤相關研究中的組織樣本檢測。

一、產品基本特性

該抗體為兔多克隆抗體，以全IgG形式提供，未經標記。其特異性靶點為53BP1（TP53BP1，p53結合蛋白1），同時識別人和小鼠樣本，適用于跨物種的組織切片分析。

抗體經抗原親和純化處理：采用固相載體上固定的53BP1特異性表位進行吸附洗脫，有效去除血清非特異性IgG，確保IHC染色低背景。免疫原對應人53BP1蛋白第350至400位氨基酸區域（參考序列NP_005648.1，基因ID 7158）。該表位位于蛋白N端區域，避開了C端的BRCT結構域和Tudor結構域，保證了特異性識別。

抗體濃度標定為100 ?g/ml（采用比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4），適用于IHC應用，建議稀釋后使用。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。反復凍融會導致抗體變性聚集，顯著降低染色效價。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光、避免溫度波動的情況下可維持完整活性。

緩沖液組成：Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA（牛血清白蛋白）作為穩定蛋白，以及0.09%疊氮鈉作為防腐抗菌劑。

注意事項：疊氮鈉會抑制HRP活性。若后續使用HRP標記的二抗檢測系統，需通過充分洗滌（至少3次PBS）去除疊氮鈉殘留。對于熒光檢測系統，疊氮鈉無顯著干擾。

三、推薦應用：免疫組織化學 (IHC)

該抗體專為IHC應用開發和驗證，適用于福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片及冰凍切片。

1. 工作稀釋范圍

稀釋度：1:100 – 1:500

起始建議：從1:100開始，根據信號強度和背景情況可進一步稀釋至1:200或1:500。說明書提示“In some cases, the antibody may be diluted further than indicated”，意味著在優化后可嘗試更高稀釋度（如1:800）。

2. 抗原修復（必需）

Epitope exposure is recommended – 強烈推薦進行抗原修復。

推薦方法：檸檬酸鹽緩沖液（Citrate buffer, pH 6.0）熱誘導修復。

具體操作：將切片置于檸檬酸鹽修復液中，微波爐高火加熱至沸騰后轉中低火維持10–15分鐘；或使用高壓鍋修復2–3分鐘。

效果說明：說明書明確指出“Epitope exposure with citrate buffer will enhance staining”，使用檸檬酸緩沖液可顯著增強染色信號。

替代方法：如檸檬酸修復效果不理想，可嘗試EDTA緩沖液（pH 8.0或9.0），但可能增加背景。

注意事項：修復后讓切片自然冷卻至室溫（約20分鐘），避免快速降溫導致組織脫落。

3. 冰凍切片適用性

Likely to work with frozen sections – 該抗體很可能適用于冰凍切片。對于冰凍組織（OCT包埋，未經固定或輕度固定），抗原修復步驟可簡化或省略（改用丙酮固定后PBS洗滌即可）。建議對冰凍切片進行預實驗驗證。

4. 詳細IHC操作流程

試劑準備

一抗稀釋液：建議使用含1% BSA和0.1% Triton X-100的PBS。

封閉液：5%正常血清（來源與二抗宿主匹配，如山羊抗兔二抗則用正常山羊血清）+ 1% BSA。

檢測系統：推薦使用HRP聚合物檢測系統（如EnVision+）或生物素-鏈霉親和素系統，配合DAB顯色。

步驟

1. 脫蠟與水化（僅FFPE切片）：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分鐘 → 梯度乙醇（100%、95%、70%各5分鐘）→ 蒸餾水洗。

2. 抗原修復：將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波熱修復（方法見上）→ 自然冷卻 → PBS洗滌3次×5分鐘。

3. 內源性過氧化物酶滅活（若使用HRP檢測）：3% H?O?甲醇溶液室溫孵育10分鐘 → PBS洗滌3次×5分鐘。

4. 封閉：滴加封閉液，室溫濕盒內孵育30分鐘。無需洗滌。

5. 一抗孵育：甩去封閉液，滴加用稀釋液配制的53BP1抗體（1:100–1:500），4°C濕盒內過夜（或37°C孵育1–2小時）。過夜孵育通常能獲得更強信號。

6. 洗滌：PBS-T（含0.1% Tween-20）洗滌3次×5分鐘。

7. 二抗孵育：滴加HRP標記的羊抗兔二抗（推薦使用聚合HRP二抗以提高靈敏度），室溫孵育30–60分鐘。

8. 洗滌：PBS-T洗滌3次×5分鐘。

9. 顯色：新鮮配制DAB底物液，滴加至切片，顯微鏡下控制顯色時間（通常1–10分鐘，出現棕黃色陽性信號即終止）。

10. 復染：蘇木精復染30秒–1分鐘 → 自來水藍化 → 梯度乙醇脫水 → 二甲苯透明 → 中性樹膠封片。

四、質控與儲存注意事項

生產國家：美國  

純化工藝：表位特異性親和純化，確保IHC染色的特異性。  

質量控制建議：每批新抗體建議使用已知陽性組織（如人扁桃體）進行染色驗證，并設置以下對照：

陰性對照：同型兔IgG替代一抗。

空白對照：省略一抗，僅用二抗。

分裝建議：由于濃度較低（100 ?g/ml）且不宜冷凍，建議按單次實驗用量分裝至微量離心管中，避免反復開蓋導致污染或效價下降，所有分裝管仍應儲存于2–8°C，切勿冷凍。