山羊抗人IgM-Fc片段抗體HRP偶聯物，徹底排除輕鏈及其它同型干擾

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的HRP（辣根過氧化物酶）直接標記的抗人IgM-Fc山羊多克隆抗體（貨號：A80-100P）的完整技術參數、標準化操作流程及應用要點。該抗體適用于ELISA、免疫細胞化學（ICC）、免疫組織化學（IHC）及蛋白質印跡（WB）等多種免疫檢測平臺，主要用于特異性檢測人IgM的重鏈恒定區（Fc段）。

一、產品基本特性

該抗體為山羊多克隆抗體，以全IgG形式提供，經HRP（辣根過氧化物酶）直接偶聯，無需二抗孵育步驟，簡化實驗流程。其特異性靶點為人IgM重鏈的Fc區，經固相吸附處理確保類特異性（僅識別IgM，不識別IgG、IgA、IgE等），同時由于針對Fc片段設計，不識別IgM的Fab段及游離輕鏈。

抗體經抗原親和純化：采用人IgM抗原偶聯的瓊脂糖珠進行親和層析分離，隨后與HRP按4:1的摩爾比（酶：抗體） 偶聯。該比例在保持抗體結合活性的同時提供了足夠的酶標記密度，確保檢測靈敏度。

抗體濃度標定為1 mg/ml（采用比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4）。包裝形式為液體，總蛋白量未標注，可按需取用。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。冷凍會導致HRP失活及抗體聚合。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光保存（HRP對光敏感）可維持完整活性。

緩沖液組成：磷酸鹽緩沖液（PBS），含0.2% BSA（牛血清白蛋白）作為穩定蛋白，以及0.05% Pro-Clean 400作為防腐抗菌劑（替代疊氮鈉，因疊氮鈉會抑制HRP活性）。

關鍵優勢：緩沖液中不含疊氮鈉，可直接用于HRP檢測系統，無需額外洗滌去除。Pro-Clean 400為新型防腐劑，對HRP無抑制作用。

三、推薦應用與操作流程

以下稀釋度范圍為推薦起始條件，實際最佳稀釋度需根據樣本類型和實驗體系進行滴定。

1. 酶聯免疫吸附測定 (ELISA)

稀釋范圍：1:10,000 – 1:100,000

應用場景：直接ELISA（檢測包被的人IgM）、夾心ELISA（作為檢測抗體）、競爭ELISA。

操作建議：

包被：用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋捕獲抗體或抗原，4°C過夜。

封閉：使用含1% BSA或5%脫脂奶粉的PBS-T（0.05% Tween-20），室溫1小時。

一抗（本抗體）孵育：按1:10,000起始稀釋于封閉液中，室溫1小時。若信號過強，可稀釋至1:50,000–1:100,000。

洗滌：PBST洗滌3–5次。

顯色：加入TMB底物（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺），避光反應5–15分鐘，終止后讀取450 nm吸光度。

靈敏度：可檢測低至ng/ml級別的人IgM。

2. 免疫細胞化學 (ICC)

稀釋范圍：1:200 – 1:2,000

樣本準備：細胞爬片或培養于孔板中的貼壁細胞（需固定和透化）。

操作流程：

固定：4%多聚甲醛室溫10–15分鐘。

透化：0.1% Triton X-100（或0.5% saponin）室溫10分鐘（若檢測胞內/膜表面IgM）。

封閉：含3% BSA或10%正常兔血清的PBS，室溫30分鐘。

一抗孵育：按1:200–1:500稀釋于封閉液中，4°C過夜或室溫1–2小時。

洗滌：PBS洗滌3次，每次5分鐘。

顯色：DAB底物（棕色）或熒光HRP底物（如TSA）。對于熒光檢測，推薦使用酪胺信號放大系統。

復染：蘇木精（明場）或DAPI（熒光）。

陽性對照：人扁桃體組織切片或EBV轉化的B細胞系（如Raji）。

3. 免疫組織化學 (IHC)

稀釋范圍：1:200 – 1:2,000

樣本類型：福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）或冰凍切片。

抗原修復：FFPE切片需進行熱誘導抗原修復（檸檬酸緩沖液pH 6.0或EDTA緩沖液pH 8.0，高壓或微波處理）。

內源性過氧化物酶滅活：3% H?O?甲醇溶液室溫孵育10–15分鐘（在封閉前進行）。

封閉：5%正常血清（來源與二抗宿主匹配，此處用兔血清）+ 1% BSA，室溫30分鐘。

一抗孵育：按1:200–1:500稀釋，4°C過夜。

洗滌：PBS-T洗滌3次。

顯色：DAB底物（避免顯色過深），蘇木精復染。

注意事項：因抗體直接標記HRP，無需生物素-鏈霉親和素放大系統，但若信號弱可使用HRP聚合物增強試劑。

4. 蛋白質印跡 (WB)

稀釋范圍：1:2,000 – 1:20,000

樣本處理：人血清、血漿、細胞裂解物或純化IgM。IgM分子量約900 kDa（五聚體） 或 170 kDa（單體），還原條件下重鏈約70 kDa。

凝膠與轉膜：

非還原條件：檢測天然五聚體IgM，使用3–8% Tris-醋酸凝膠，轉膜時間延長（100 V，2小時）。

還原條件（檢測IgM重鏈）：使用10% SDS-PAGE，常規濕轉（100 V，1小時）。

封閉：5%脫脂奶粉-TBST，室溫1小時。

一抗孵育：按1:2000–1:5000稀釋（TBST + 1% BSA），4°C過夜。

洗滌：TBST洗滌3次，每次10分鐘。

顯色：化學發光底物（ECL），曝光時間根據信號強度調整。

預期條帶：還原條件下在70–75 kDa處出現重鏈條帶；非還原條件下在~900 kDa（五聚體）或~170 kDa（單體）處出現彌散或高分子量條帶。

四、特異性與交叉反應性

類特異性：經固相吸附和親和純化處理，該抗體特異性識別人IgM重鏈Fc區。通過免疫電泳和ELISA驗證，與其他人免疫球蛋白（IgG、IgA、IgE）及輕鏈的交叉反應性<1%。

物種交叉反應：可能與其他物種（如猴、小鼠、大鼠）的IgM發生交叉反應，但未經驗證。如需用于非人樣本，建議預先通過ELISA或WB測試交叉反應程度。

Fc特異性優勢：抗Fc活性確保僅識別IgM完整分子的Fc部分，而不識別Fab片段。這一特性使該抗體適用于檢測分泌型IgM（含Fc）或膜結合型IgM（mIgM的Fc部分暴露），且不會與游離輕鏈或部分降解的IgM片段產生非特異性結合。