兔抗GW182抗體親和純化，實現180kDa大分子RNA結合蛋白超敏檢測

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人GW182（TNRC6A）蛋白的兔源多克隆抗體（貨號A302-329A）的完整技術參數、標準化操作流程及功能應用指南。該抗體適用于RNA干擾、miRNA介導的基因沉默及P小體（GW小體）結構與功能研究。

一、產品基本特性

該抗體為兔多克隆抗體，以全IgG形式提供，未經任何標記。其特異性靶點為GW182（又稱TNRC6A、甘氨酸-色氨酸蛋白182 kDa），僅識別人源樣本，適用于人細胞系或組織裂解物的檢測。

抗體經抗原親和純化處理：通過固相載體上固定的GW182特異性表位進行吸附洗脫，高效去除血清中的非特異性IgG，確保高純度與低背景。免疫原對應人GW182蛋白第575至625位氨基酸區域（參考序列NP_055309.2，基因ID 27327）。該表位位于蛋白中部區域，避開了C端的RNA結合域和N端的Argonaute相互作用域，保證了與其他TNRC6家族成員（TNRC6B、TNRC6C）的交叉反應風險較低。

抗體濃度標定為1000 ?g/ml（采用比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4）。高濃度設計便于靈活稀釋，適應不同應用需求。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。反復凍融會破壞抗體天然構象，導致效價下降或形成聚集體。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光、避免溫度波動的情況下可維持完整活性。

緩沖液組成：Tris-枸櫞酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊氮鈉作為防腐抗菌劑。

關鍵注意事項：疊氮鈉會共價修飾HRP的酪氨酸殘基，不可逆抑制酶活性。若后續使用HRP標記二抗進行化學發光檢測，必須通過充分洗滌（至少5次，每次5分鐘）去除疊氮鈉；或選用不含疊氮鈉的替代緩沖體系（如含0.02%硫柳汞的PBS）。對于直接偶聯HRP的一抗，本產品不適用。

三、推薦應用與操作流程

1. 免疫沉淀 (IP)

抗體用量：6 ?g抗體 / mg總蛋白裂解物。以一碟10 cm培養皿的哺乳動物細胞（80–90%融合度）為例，總蛋白量約為1–2 mg，推薦添加12 ?g抗體（即12 ?l原液）。

裂解液選擇：GW182主要定位于細胞質中的GW小體（又稱P小體），這些結構對去垢劑敏感。推薦使用溫和的非變性IP裂解緩沖液：50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40 或 0.3% CHAPS。避免使用高濃度SDS或強離子去垢劑，以免破壞GW小體復合物。裂解液中需新鮮加入蛋白酶抑制劑（PMSF、cocktail）和RNase抑制劑（如SUPERase·In，1 U/?l）以保護RNA-蛋白復合物。

操作步驟：澄清裂解液與抗體于4°C旋轉孵育2小時至過夜（過夜有助于富集低豐度GW182及其互作蛋白）。隨后加入Protein A/G磁珠（或瓊脂糖珠），繼續孵育1–2小時。磁珠用裂解緩沖液洗滌3–5次（洗滌緩沖液中可維持0.1% NP-40），最后加入SDS上樣緩沖液，95°C變性5分鐘。

2. 蛋白質印跡 (WB)

工作稀釋度：1:2000 – 1:10,000。初次實驗建議從1:2000開始；若信號過強或背景升高，可逐步稀釋至1:5000或1:10,000。

凝膠體系：GW182分子量極大（理論值約182 kDa，實際由于重復序列遷移可能異常），推薦使用3–8% Tris-醋酸凝膠以獲得最佳分辨率。常規Tris-甘氨酸凝膠也能檢測，但大分子分離效果較差，可能導致條帶拖尾或轉移不充分。

封閉與稀釋液：含5%脫脂奶粉的TBST（Tris-緩沖鹽 + 0.1% Tween-20）。避免使用BSA，因可能導致非特異性背景。

一抗孵育：4°C過夜（12–16小時）。短時室溫孵育不足以檢測低豐度、高分子量蛋白。

二抗選擇：

細胞裂解物直接WB：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗（如A120-101P），按1:5000–1:20000稀釋。

IP后WB檢測：免疫沉淀洗脫物中包含兔IgG重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）。GW182分子量約180 kDa，遠高于重鏈和輕鏈，常規抗兔全IgG二抗不會造成干擾。但若同時檢測共沉淀的低分子量蛋白（如Argonaute ~97 kDa），建議使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP二抗，并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以封閉非特異性Fc受體。

轉膜條件：由于GW182分子量大，建議使用0.45 ?m PVDF膜（硝酸纖維素膜對大分子結合效率低）。濕轉法：100 V，2–2.5小時（冰?。┗?30 V，4°C過夜。甲醇濃度控制在5–10%之間，過高會導致大蛋白沉淀。轉膜后可用麗春紅染色確認大分子蛋白是否轉移成功。

四、靶點生物學背景

GW182（glycine-tryptophan protein of 182 kDa）是TNRC6家族（含三核苷酸重復序列6A）的核心成員，在RNA干擾和miRNA介導的基因沉默中發揮關鍵作用。其名稱來源于蛋白中豐富的甘氨酸-色氨酸重復基序（GW基序），這些基序直接結合Argonaute蛋白（AGO1-4），形成RNA誘導沉默復合物（RISC）的核心效應模塊。

GW182的生物學功能主要包括：

介導轉錄后基因沉默：通過結合AGO蛋白和靶mRNA，GW182招募下游效應因子（如PAN2-PAN3和CCR4-NOT去腺苷酸酶復合物），促進靶mRNA的去腺苷酸化、脫帽和降解，或抑制翻譯起始。

定位于P小體/GW小體：GW182是細胞質中P小體（處理小體，又稱GW小體）的標志性蛋白。這些無膜細胞器是mRNA降解和儲存的場所。抑制GW182表達會導致其他P小體蛋白（如DCP1a、AGO2）定位紊亂，并削弱RNAi和miRNA沉默效率。

參與多種生理病理過程：GW182功能異常與癌癥、神經系統疾?。ㄈ邕z傳性癲癇FAME6）及病毒感染相關。

GW182分子量約為182 kDa，但由于其內部含有大量重復序列（如富含谷氨酰胺和脯氨酸的區域），在SDS-PAGE中可能表現出異常的遷移行為（實際觀察到的條帶可能在170–200 kDa之間）。

五、別名與同源性

該抗體識別人GW182蛋白的575–625殘基（即免疫原對應的表位區）。該區域在TNRC6家族三個成員（TNRC6A、TNRC6B、TNRC6C）中保守性較低，因此本抗體對TNRC6A/GW182具有高特異性，不會顯著交叉識別TNRC6B或TNRC6C。使用前建議通過siRNA敲低驗證特異性。

常見別稱包括：

GW1 / GW182自身抗原

三核苷酸重復序列基因6A蛋白

CAG重復蛋白26（CAGH26）

EMSY相互作用蛋白

FAME6（家族性顳葉癲癇6型）