兔抗LATS1抗體親和純化，實現Hippo通路核心激酶超敏檢測

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人及小鼠LATS1（大腫瘤抑制激酶1）的兔源多克隆抗體（貨號A300-477A）的完整技術參數、標準化實驗流程及功能應用要點。該抗體適用于細胞周期調控、Hippo信號通路及腫瘤抑制機制研究。

一、產品基本特性

該抗體為兔多克隆抗體，以全IgG形式提供，未經標記。其特異性靶點為LATS1（又稱WARTS、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶LATS1），同時識別人和小鼠樣本，適用于跨物種比較研究。

抗體經抗原親和純化處理：采用固相載體上固定的LATS1特異性表位進行吸附洗脫，有效去除血清非特異性IgG，確保高純度與低背景。免疫原對應人LATS1蛋白第50至100位氨基酸區域（參考SwissProt條目O95835，基因ID 9113）。該表位位于蛋白N端調控區，遠離C端激酶結構域，避免了與其他NDR家族激酶（如LATS2、NDR1/2）的交叉識別。

抗體濃度標定為200 ?g/ml（采用比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4），較同類產品濃度適中，適合常規實驗用量。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。反復凍融會導致抗體變性聚合，顯著降低效價。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光、避免溫度波動的情況下可維持完整活性。

緩沖液組成：Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA（牛血清白蛋白）作為穩定蛋白，以及0.09%疊氮鈉作為防腐抗菌劑。

注意事項：BSA的存在有助于防止抗體在低濃度下吸附管壁，但疊氮鈉會抑制HRP活性。若后續使用HRP標記二抗進行化學發光檢測，需通過充分洗滌（至少5次，每次5分鐘）去除疊氮鈉，或選用不含疊氮鈉的替代緩沖體系。對于直接偶聯HRP的一抗，本產品不適用。

三、推薦應用與操作流程

1. 免疫沉淀 (IP)

抗體用量：6 ?g抗體 / mg總蛋白裂解物。以一碟10 cm培養皿的哺乳動物細胞（80–90%融合度）為例，總蛋白量約為1–2 mg，推薦添加12 ?g抗體（即60 ?l原液）。

裂解液選擇：推薦使用非變性IP裂解緩沖液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 或 0.5% Triton X-100），并新鮮加入蛋白酶抑制劑（PMSF、cocktail）和磷酸酶抑制劑（如NaF、Na3VO4）。LATS1在Hippo通路中受磷酸化調控，保留磷酸化狀態對于功能分析至關重要。

操作步驟：澄清裂解液與抗體于4°C旋轉孵育2小時至過夜（過夜富集效率更高）。隨后加入Protein A/G磁珠或瓊脂糖珠，繼續孵育1–2小時。磁珠用裂解緩沖液洗滌3–5次后，加入含DTT的SDS上樣緩沖液，95°C變性5分鐘。

2. 蛋白質印跡 (WB)

工作稀釋度：1:5000 – 1:15,000。該范圍較寬，充分體現了抗體的高靈敏度。初次實驗建議從1:5000起始；若信號過強或背景偏高，可逐級稀釋至1:10,000或1:15,000。

凝膠體系：LATS1分子量約123–130 kDa，可采用常規7.5%或10% Tris-甘氨酸凝膠進行分離。若需同時檢測小分子量蛋白，可選擇梯度凝膠（4–20%）。

封閉與稀釋液：含5%脫脂奶粉的TBST（Tris-緩沖鹽 + 0.1% Tween-20）。避免使用BSA，因可能導致非特異性背景。

一抗孵育：4°C過夜（12–16小時）。短時室溫孵育不足以檢測低豐度信號，尤其在研究磷酸化調控中的遷移變化時。

二抗選擇：

細胞裂解物直接WB：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗（如A120-101P），按1:5000–1:20000稀釋。

IP后WB檢測：免疫沉淀樣品中包含兔IgG重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）。由于LATS1分子量約130 kDa，遠高于重鏈，常規抗兔全IgG二抗基本不受干擾。但若同時檢測輕鏈附近的共沉淀蛋白（約25 kDa），則必須使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP二抗，并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以封閉非特異性Fc受體。

轉膜條件：推薦使用0.45 ?m PVDF膜，濕轉法：100 V，1.5小時（冰?。┗?30 V，4°C過夜。甲醇濃度維持20%以促進蛋白與膜結合。

3. 跨物種應用提示

該抗體已驗證小鼠和人反應性。若用于大鼠或其他物種樣本，建議通過BLAST比對目標表位區域（人LATS1 50–100殘基）的同源性。小鼠LATS1在該區域與人有約95%相似性，預期可識別。

四、靶點生物學背景

LATS1（大腫瘤抑制因子同源物1）是Hippo信號通路的核心激酶，最初在果蠅中作為warts基因的同源物被鑒定，在人類中發揮腫瘤抑制功能。LATS1屬于NDR家族（Dbf2相關激酶家族），是有絲分裂退出網絡的關鍵組分。

LATS1的生物學功能主要包括：

負調控G2/M期轉變：通過與MOB1、CDC2激酶相互作用，下調CDC2激酶活性，阻滯細胞周期進程，防止異常有絲分裂。

介導Hippo信號轉導：在MST1/2激酶磷酸化激活后，LATS1磷酸化下游效應因子YAP和TAZ，促進其細胞質滯留和降解，從而抑制細胞增殖、誘導凋亡。

腫瘤抑制：LATS1表達缺失或功能突變與肉瘤、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤相關。LATS1敲除小鼠表現出組織過度生長和腫瘤易感性。

LATS1本身活性受磷酸化調控：MST1/2磷酸化LATS1的Thr1079（在激酶結構域內）及多個疏水基序位點，使其激活。因此，檢測LATS1總蛋白和磷酸化形式時，需要高特異性的總抗體。

五、別名與同源性

該抗體識別人和小鼠LATS1的N端50–100殘基區域，該區域在哺乳動物中高度保守。常見別稱包括：

WARTS蛋白激酶

h-warts

大腫瘤抑制因子同源物1

wts（果蠅同源物命名）

注意：LATS1與LATS2（另一種Hippo通路激酶）在C端激酶結構域有較高同源性，但N端50–100區域差異較大，因此本抗體對LATS1具有特異性，不識別LATS2。