兔抗ATR抗體親和純化，支持輕鏈專用二抗消除背景干擾

本文系統介紹由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人ATR蛋白的兔源多克隆抗體（貨號A300-137A）的核心技術參數、標準化操作流程及功能應用要點，適用于DNA損傷應答、復制脅迫響應及細胞周期檢查點調控等研究領域。

一、產品基本特性

該抗體為兔多克隆抗體，以全IgG形式提供，未經標記修飾。其特異性靶點為ATR（共濟失調毛細血管擴張癥與Rad3相關蛋白，又稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATR），僅識別人源樣本，適用于人類細胞系或組織裂解物的檢測。

抗體經抗原親和純化處理：通過固相載體上固定的ATR特異性表位進行吸附洗脫，有效去除血清中的非特異性IgG，確保高純度與低背景。免疫原對應人ATR蛋白第400至450位氨基酸區域（參考序列NP_001175.1，基因ID 545）。該表位位于蛋白N端附近，避免了與ATM、DNA-PKcs等其他PI3K家族激酶的交叉識別。

抗體濃度標定為1000 ?g/ml（采用比爾定律測定，1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4）?？偟鞍琢课礃俗?，可根據實際需要按量取用。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。反復凍融會破壞抗體天然構象，導致效價下降或形成聚集體。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光、避免溫度波動的情況下可維持完整活性。

緩沖液組成：Tris-枸櫞酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊氮鈉作為抗菌防腐劑。

關鍵注意事項：疊氮鈉會共價修飾HRP的酪氨酸殘基，不可逆抑制酶活性。若后續使用HRP標記二抗進行化學發光檢測，必須通過充分洗滌（至少5次，每次5分鐘）去除疊氮鈉；或選用不含疊氮鈉的配方（如含0.02%硫柳汞的PBS）。對于直接偶聯HRP的一抗，本產品不適用。

三、推薦應用與操作流程

1. 免疫沉淀 (IP)

抗體用量：6 ?g抗體 / mg總蛋白裂解物。通常一個10 cm培養皿的貼壁細胞（80–90%融合度）總蛋白量約1–2 mg，需添加12 ?g抗體。

裂解液選擇：推薦使用非變性IP裂解緩沖液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40 或 0.3% CHAPS）。由于ATR是核內蛋白且與染色質緊密結合，建議裂解前用低鹽緩沖液預洗細胞，裂解后輔以Benzonase核酸酶（25 U/ml）或超聲處理（功率30%，5秒脈沖/5秒間隔，共1分鐘），以釋放染色質結合的ATR。

操作步驟：抗體與澄清裂解液于4°C旋轉孵育2小時至過夜（過夜有利于低豐度蛋白富集）。隨后加入Protein A/G磁珠（或瓊脂糖珠），繼續孵育1–2小時。磁珠用裂解緩沖液洗滌3–5次后，加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸變性。

2. 蛋白質印跡 (WB)

工作稀釋度：1:2000 – 1:10,000。初次實驗建議從1:2000開始；若信號過強或背景升高，可逐步稀釋至1:5000或1:10000。

凝膠體系：3–8% Tris-醋酸凝膠（必需）。ATR分子量極大（約300 kDa），常規Tris-甘氨酸凝膠無法有效分離高分子量蛋白，易導致條帶拖尾或完全無法轉入膜。Tris-醋酸體系配合低濃度丙烯酰胺可提供更好的大分子分辨率。

封閉與稀釋液：含5%脫脂奶粉的TBST（Tris-緩沖鹽 + 0.1% Tween-20）。避免使用BSA，因其可能引入非特異性背景。

一抗孵育：4°C過夜（12–16小時）。短時室溫孵育不足以檢測低豐度核蛋白。

二抗選擇：

細胞裂解物直接WB：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗（如A120-101P），按說明書推薦稀釋度（通常1:5000–1:20000）。

IP后WB檢測：免疫沉淀洗脫物中包含兔IgG重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）。由于ATR分子量為300 kDa，遠高于重鏈和輕鏈，常規抗兔全IgG二抗不會產生干擾。但若同時檢測ATR的磷酸化修飾或低分子量的共沉淀蛋白，建議使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP二抗，并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以封閉非特異性Fc受體。

轉膜條件：建議使用0.45 ?m PVDF膜（硝酸纖維素膜易脆且對大分子結合效率低）。濕轉法：100 V，2.5小時（冰?。┗?30 V，4°C過夜。甲醇濃度控制在5–10%之間，過高會導致大蛋白沉淀。

分子量預期：全長ATR約300 kDa，可能出現降解條帶（~250 kDa、150 kDa），屬常見現象，尤其在蛋白酶抑制不足或反復凍融樣本中。

四、靶點功能與生物學背景

ATR是磷脂酰肌醇3激酶相關激酶家族（PIKK）的核心成員，與ATM、DNA-PKcs同源。不同于ATM主要響應DNA雙鏈斷裂，ATR更專一地感知DNA復制脅迫和紫外線損傷。當復制叉停滯或單鏈DNA暴露時，ATR通過其相互作用蛋白ATRIP（ATR相互作用蛋白）結合RPA包被的單鏈DNA，進而被激活。

ATR激酶通過磷酸化下游底物啟動檢查點信號通路，介導細胞周期阻滯（S期和G2/M期）、復制叉穩定、DNA修復或凋亡。已知底物包括：

BRCA1（調控同源重組）

p53（誘導細胞周期阻滯或凋亡）

Chk1（關鍵效應激酶，觸發S期和G2/M期檢查點）

Rad17（加載PCNA樣復合物至損傷位點）

E2F1（調控轉錄）

ATR基因突變可導致塞克爾綜合征（Seckel syndrome，表現為小頭畸形和侏儒癥）以及更廣泛的DNA損傷應答缺陷。ATR抑制劑已在腫瘤治療中進入臨床試驗，用于聯合PARP抑制劑或化療藥物協同殺傷復制應激高的癌細胞。

五、別名與同源性

該抗體識別人ATR蛋白的400–450殘基，該區域在哺乳動物中具有較高的保守性，但反應性僅驗證為人，不推薦用于小鼠、大鼠或其他物種，除非經序列比對驗證100%一致。

常見別稱：

共濟失調毛細血管擴張癥與Rad3相關蛋白

FRAP相關蛋白1（FRP1）

MEC1同源物

SCKL1（塞克爾綜合征1型）